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Expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) de tumores pancreáticos humanos
MacLean Hall, Hao Liu, [...] e Amod A. Sarnaik
Dados Associados
- Declaração de disponibilidade de dados
-
Não aplicável.
Abstrato
fundo
Nós avaliamos se os linfócitos infiltrantes tumorais (TIL) poderiam ser expandidos a partir de tumores cirurgicamente ressecados de pacientes com câncer pancreático.
Métodos
Tumores foram ressecados de pacientes com câncer pancreático. Os tumores foram picados em fragmentos e cultivados em meio contendo alta dose de interleucina-2 (IL-2) por até 6 semanas. O fenótipo das células T, os marcadores de ativação e a reatividade foram medidos.
Resultados
A expansão da TIL foi medida em 19 amostras de pacientes. A maioria destes TIL eram células T CD4 + e foram altamente ativados. Células T CD8 + purificadas produziram IFN-γ em resposta a alvos tumorais pancreáticos HLA compatíveis. O bloqueio de PD-1 e a estimulação de 4-1BB foram demonstrados como estratégias eficazes para melhorar o rendimento eficaz de TIL, incluindo a produção de TIL pancreático-reativo ao tumor.
Conclusões
A TIL expandida a partir de tumores pancreáticos é funcional e capaz de responder a antigénios associados a tumores pancreáticos. O bloqueio da PD-1, a estimulação com 41BB e o enriquecimento das células T CD8 + são estratégias eficazes para melhorar o rendimento da TIL e a reatividade do tumor. Estes resultados apoiam o desenvolvimento de estratégias de terapia celular adotiva usando TIL para o tratamento do câncer de pâncreas.
Material suplementar eletrônico
A versão online deste artigo (doi: 10.1186 / s40425-016-0164-7) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados.
fundo
O adenocarcinoma pancreático é a quarta principal causa de mortalidade relacionada ao câncer nos Estados Unidos. Os pacientes diagnosticados com esta doença têm uma taxa de sobrevida de 5 anos inferior a 5%, e os únicos tratamentos disponíveis, cirurgia, quimioterapia e quimiorradiação, mostraram eficácia limitada [ 1 , 2 ]. Apenas uma pequena fração (20%) desses pacientes é ainda elegível para cirurgia com intenção curativa, e a maioria desenvolverá doença recorrente dentro de 2 anos de terapia definitiva [ 3 ]. Portanto, estratégias alternativas de tratamento são urgentemente necessárias.
Sucessos recentes em imunoterapia para o tratamento do melanoma metastático resultaram em sua aplicação a outros tipos de câncer. Especificamente, a terapia celular adotiva (ACT) é uma abordagem particularmente promissora que utiliza linfócitos endógenos infiltrantes do tumor (TIL), que são expandidos in vitro a partir de um tumor cirurgicamente ressecado e, em seguida, re-infundidos de volta para o paciente. Esta terapia para pacientes com melanoma metastático está associada a uma resposta completa de 20% que dura mais de 3 anos [ 4 ]. Em pacientes com tumores gastrintestinais (GI), a infiltração de células T CD3 + está associada a uma taxa mais alta de sobrevida livre de progressão [ 5 ], e adenocarcinomas pancreáticos contendo CD4 + e CD8 +As células T correlacionaram-se com um prognóstico melhorado e uma sobrevida de 5 anos significativamente maior para esses pacientes [ 6 - 8 ]. Portanto, há evidências de uma resposta imune das células T hospedeiras em pacientes com adenocarcinoma de pâncreas, apoiando a possível aplicação de ACT usando TIL para esta histologia do câncer.
Correspondentemente, não há escassez de estudos demonstrando que o microambiente tumoral do adenocarcinoma pancreático é inerentemente imunossupressor, com uma vasta gama de mecanismos para escapar da vigilância imunológica. Estes incluem os ligandos co-inibidores, tais como PDL1 e PDL2, que interagem directamente com as células T para amortecer a sua resposta efectora [ 9 - 12 ], células T reguladoras [ 13 - 17 ], apresentação reduzida de antigénio [ 18 ], e citocinas supressoras [ 19 - 21 ]. Além disso, o TIL ativado regula as moléculas do ponto de checagem, como a PD-1, que pode atenuar a intensidade da resposta inflamatória e induzir tolerância aos antígenos tumorais [ 22].].
Apesar de todos esses fatores, a TIL expandida in vitro para grandes números tem o potencial de ser reprogramada como efetores de uma resposta antitumoral produtiva [ 4 ]. De facto, foi recentemente demonstrado que PD-1 + TIL representa o repertório de células reactivas ao tumor expandidas clonalmente no melanoma [ 23 ]. Identificar e direcionar subconjuntos TIL enriquecidos, específicos para tumores, in vitro e in vivo, é uma área ativa de pesquisa destinada a aumentar o crescimento e a função da TIL, a fim de melhorar a eficácia da ACT.
No presente estudo, expandimos com sucesso TIL de 19 pacientes com adenocarcinoma pancreático na presença de altas doses de IL-2. A maioria destes TIL eram células T CD4 + e foram altamente ativados. Tanto o bloqueio de PD-1 como o agonismo de 4-1BB levaram a melhores rendimentos de TIL. O enriquecimento das células T CD8 + foi uma estratégia eficaz para medir o TIL pancreático reativo ao tumor. Estes resultados suportam o uso de TIL expandido de tumores pancreáticos em estratégias ACT para pacientes com adenocarcinoma pancreático.
Resultados
Pancreatic TIL são predominantemente CD4
A fim de estabelecer a viabilidade de isolar e expandir TIL de adenocarcinomas pancreáticos, adaptamos nossa experiência anterior com melanoma para estabelecer culturas TIL pancreáticas [ 24].]. Os tumores foram cirurgicamente ressecados de 20 pacientes diferentes com câncer pancreático no Moffitt Cancer Center e usados para montar culturas de fragmentos de tumor para o isolamento e propagação de TIL. Digno de nota, o volume de tumor recebido no laboratório após a análise patológica foi consideravelmente menor comparado àqueles tipicamente obtidos para derivar o melanoma TIL. Isto resultou em uma média de 14,3 fragmentos de tumor de espécimes de câncer pancreático ressecados dos quais TIL foram inicialmente propagados, comparado com mais de 48 fragmentos de uma ressecção típica de melanoma. Apesar disso, os TIL foram isolados com sucesso de pelo menos um fragmento em 19 dos 20 pacientes (95%) na presença de altas doses de IL-2 (6000 UI / mL) após 3 a 6 semanas de cultura (Tabela 1 e Arquivo adicional 1: Tabela S1) e foram predominantemente células T CD4 + . O rendimento de TIL variou entre amostras de pacientes com um rendimento médio de 1,79x10 7 TIL, de uma média de pouco mais de 14 fragmentos por paciente. Quatro amostras das 17 (23,5%) medidas deram origem a pelo menos 25 milhões de TIL, o número mínimo necessário para o início de um protocolo de expansão rápida em escala clínica (REP). Extrapolado para os 48 fragmentos tipicamente estabelecidos durante uma expansão de escala clínica, o rendimento médio aumentou para mais de 83 milhões de TIL, com nove de 17 (52,9%) amostras atendendo ao limiar de iniciação do REP. A maioria destes TIL expandidos era CD4 + (66,1 ± 21,0%), enquanto os linfócitos T CD8 + compreendiam uma média de 25,6 ± 17,0% (Figura 1a ). O CD3 restante analisado+ TIL não dentro destas portas positivas únicas foram predominantemente duplas células negativas. Importante, TIL pancreático também foram capazes de REP, a segunda fase do crescimento TIL pré-infusão. Três amostras de pacientes foram submetidas ao REP completo de duas semanas que resultou em uma expansão de dobra média de 964 (Arquivo adicional 1 : Tabela S2), que comparou de forma semelhante à nossa experiência em melanoma TIL onde ~ 1000 vezes a expansão é observada durante o REP. Doze amostras adicionais foram submetidas a um mini-REP de 8 dias e exibiram uma expansão de 93 vezes em média ao longo desse tempo ( n = 12, dados não mostrados). Estes dados demonstram que a geração suficiente de TIL para terapia celular adotiva a partir de fragmentos de adenocarcinoma pancreático é possível, dada a aquisição de espécimes de tamanho adequado necessários para produzir os altos números de TIL necessários para iniciar o REP.
TIL pancreático tem um fenótipo ativado
Para caracterizar o fenótipo destas TIL pancreáticas expandidas, examinamos a expressão de marcadores envolvidos na ativação, diferenciação e função de células T. Como a maioria dos TIL era CD4 + , investigamos a presença de células T reguladoras (T regs ) pela coloração intracelular de FOXP3 na população CD4 + CD25 + . Descobrimos que a frequência de CD4 + CD25 + FOXP3 + T regs é bastante baixa (~ 4%) na TIL pancreática expandida como uma proporção da população total de CD3 + (Fig. 1b ). TIL eram quase inteiramente CD45RO + CCR7 -, característica de células T efectoras experimentadas com antigénio (dados não mostrados). Aproximadamente 50% das células CD8 + e 40% das células CD4 + expressaram CD69 (Fig. 1c i ), indicando uma estimulação eficiente e sustentada das células T [ 25 ]. TIL também exibiu um baixo nível de expressão de CD27 (Fig. 1c ii ), um marcador conhecido por ser regulado negativamente à medida que as células T se aproximam da diferenciação terminal [ 26 ]. Nós caracterizamos ainda o fenótipo destas culturas de TIL e descobrimos que mais de 40% das células CD8 + expressavam o marcador co-estimulatório CD28 (Fig. 1c iii ) e mais de 20% das células expressavam GITR (Fig. 1c) . iv ), um receptor crucial para a proliferação de células T CD8 + ativadas [ 27 ]. Além disso, menos de 5% de TIL foram 4-1BB + , um marcador co-estimulador que é expresso em células T ativadas após o acoplamento de TCR (Fig. 1c v ) [ 28 ]. O receptor alfa-2 da IL-2 (CD25), que é supra-regulado após estimulação com TCR, foi expresso em mais de 30% de CD4 + TIL e 20% de CD8 + TIL (Fig. 1c vi ) [ 29 ]. Dados para cada um desses marcadores fenotípicos podem ser encontrados no arquivo adicional 1: Tabela S1 por paciente. Notavelmente, como avaliado em uma pequena coorte de amostras, esses indicadores fenotípicos de ativação permaneceram praticamente inalterados, não mostrando diferença significativa por meio do REP de duas semanas (Arquivo adicional 1 : Figura S2). De um modo geral, verificou-se que o adenocarcinoma pancreático TIL que foi expandido com sucesso a partir de fragmentos de tumor expressava numerosos marcadores de experiência de ativação e antígeno e eram compostos por uma baixa frequência de Tregs.
O bloqueio da PD-1 aumenta a expansão do TIL pancreático
Além dos marcadores fenotípicos acima, nós também coramos para a presença de PD-1 no TIL pancreático. A PD-1 é um receptor co-inibitório que restringe a atividade das células T e recentemente demonstrou estar especificamente presente na TIL reativa a tumores [ 23 , 30 ]. TIL de amostras de tumor digerido analisadas por citometria de fluxo apresentaram níveis relativamente altos de PD-1, já que mais de 30% de CD4 + TIL (38,2 ± 22,1%) e 40% de CD8 + TIL (45,7 ± 26,8%) foram positivos para PD 1 (Fig. 2a ). Em contraste, o nível de expressão de PD-1 foi baixo em TIL pancreática expandida, com uma frequência de 4,8% para células T CD4 + e 6,9% para células T CD8 + (Fig. 2b ).
A detecção da expressão de PD-1 em TIL recém-isolada levou a uma investigação sobre se o bloqueio da sinalização inibitória da PD-1 na cultura inicial poderia afetar o resultado do crescimento da TIL pancreática. Um anticorpo antagonista PD-1 foi adicionado no inio da cultura TIL para determinar o seu efeito na propagao de TIL a partir de tumores pancreicos. Isto foi comparado com a cultura de TIL na presença de um anticorpo de controlo do isotipo. A adição do anticorpo isotipo não teve efeito na expansão TIL (dados não mostrados). O número absoluto de TIL de três pacientes aumentou drasticamente após o bloqueio de PD-1 (2,5 vezes), enquanto a freqüência de morte celular em comparação com o controle do isotipo foi inalterada (Fig. 2c, d). TIL pancreático cultivado na presença de anticorpo anti-PD-1 de um único paciente produziu significativamente mais IFN-γ na presença de uma linhagem tumoral pancreática HLA-comparada com TIL cultivada com um isotipo controle (Arquivo adicional 1 : Figura S1 ). Estes dados sugerem que a inibição da sinalização de PD-1 pode aumentar a propagação de TIL pancreático a partir de fragmentos de tumor e aumentar a expansão de células T específicas de tumores pancreáticos.
Segmentação 4-1BB aumenta a expansão do TIL pancreático
Similarmente, o efeito de um anticorpo agonista 4-1BB no crescimento TIL foi determinado através da sua adição durante a expansão TIL. Nas amostras de tumores pancreáticos digeridos, 10,8% de CD4 + TIL e 7,9% de CD8 + TIL expressaram 4-1BB (Fig. 3a ). Os fragmentos tumorais foram cultivados em IL-2 na presença ou ausência de anticorpo anti-4-1BB. Numa base por fragmento, tanto o rendimento absoluto de TIL como o número de linfócitos CD3 + CD8 + foram significativamente aumentados no grupo tratado com 4-1BB quando comparado com o controlo do isotipo. No geral, foi medida uma expansão de 3,5 vezes (Fig. 3b ), enquanto que uma diferença de 23 vezes na CD8 + TIL resultou da adição de 4-1BB agonístico (Fig. 3b). 3c ). Estes resultados suportam o direcionamento de 4-1BB como uma estratégia para expandir seletivamente célulasTCD8 + apartir de tumores pancreáticos, que se mostraram essenciais para a resposta antitumoral [ 31 ].
Potencial funcional do TIL pancreático
Para investigar se estas TIL pancreáticas expandidas são capazes de responder à estimulação extracelular, as TIL foram estimuladas com PMA e ionomicina. Após 18 h, observamos um claro aumento na expressão de superfície de CD107a, que está associada à degranulação e atividade citotóxica de células T, e IFN-γ intracelular acumulado, um importante efetor da resposta antitumoral TIL [ 32 , 33 ]. Descobrimos que mais de 50% das TIL pancreáticas CD8 +eram positivas para a expressão de IFN-γ, e mais de 70% de T8 CD8 + eram capazes de produzir CD107a ou IFN-γ (Fig. 4a, b). Nestas mesmas condições, mais de 80% do melanoma TIL foram capazes de apresentar IFN-γ (dados não mostrados). Estes dados sugerem que o TIL pancreático expandido contém o potencial funcional para induzir uma resposta antitumoral.
Como relatado acima, a maioria (66%) da TIL pancreática expandida mostrou ser CD4 + (Fig. 1a ). Embora essas células T fossem capazes de produzir IFN-γ em um nível similar ao CD8 + TIL em resposta à estimulação (Fig. 4b ), acredita-se que a resposta imune específica do tumor seja mediada primariamente por células CD8 + [ 34 ]. Para ajudar a definir a função da TIL pancreática CD8 + , enriquecemos as células CD8 + da TIL inteira pela depleção de células CD4 + . Os restantes CD8 + TIL foram então expandidos seguindo o mini-REP, conforme esquematizado na Fig. 5a . Expansão seletiva do CD8As células T + no mini-REP impediram a sua diluição por células T CD4 + e permitiram uma oportunidade acrescida para capturar a reactividade do tumor das células T CD8 + através de um ensaio de co-cultura. Os CD8 + TIL foram enriquecidos de 19% a 67% e permaneceram predominantemente CD8 + ao longo desta expansão substancial (Fig. 5b ). Além disso, estes pós-REP CD8 + TIL retiveram sua capacidade efetora em resposta à estimulação com PMA e ionomicina (Fig. 5c ), já que a maioria dos TIL expressou IFN-γ intracelular e quase um terço foi CD107a + .
TIL pancreático CD8 + são específicos do tumor
Para avaliar ainda se TIL pancreático tem especificidade tumoral, cultivaram-se CD8 + pós-REP TIL com linhas celulares pancreáticas HLA correspondentes. A quantidade de IFN-γ libertada na co-cultura foi medida após 48 h. Pâncreas TIL a partir de dois pacientes individuais produzidos significativamente mais IFN-γ na presença de linhas de tumor pancreático HLA compatíveis, em comparação com HLA-incompatíveis do tumor (Fig. 6a , b).b ). Estes dados demonstram que as células T CD8 + reactivas ao tumor estão presentes dentro do repertório de TIL pancreático e são funcionais contra antigénios de tumores pancreáticos partilhados de um modo dependente de HLA.
Discussão
O desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o adenocarcinoma pancreático é fundamental para o sucesso do tratamento e recuperação deste câncer agressivo. Na era da medicina personalizada contra o câncer, a terapia celular adotiva (TCA), que utiliza linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), representa uma oportunidade única para explorar tanto a diversidade quanto a especificidade do sistema imunológico de um paciente. As células T CD8 + dentro dessa população representam um repertório policlonal endógeno de TCRs específicos e abrangentes para o arranjo de antígenos associados a tumores (TAAs) e neoantígenos únicos presentes [ 35 ]. Dentro do cenário apropriado, esses infiltrados são efetores capazes de uma resposta antitumoral direcionada que pode ser durável e completa [ 4 ].
No presente estudo, exploramos a viabilidade de expandir a TIL a partir de adenocarcinomas pancreáticos ressecados. A ACT depende tanto da quantidade como da qualidade dos linfócitos recuperados da fonte original. É importante ressaltar que mostramos que o TIL pode ser expandido de tumores pancreáticos ressecados cirurgicamente e REP para métricas clinicamente relevantes. Dada a restrição inerente de apenas um em cada cinco pacientes com câncer de pâncreas como candidatos à cirurgia para intenção curativa, é significativo que quase todos os tumores neste estudo contivessem linfócitos capazes de propagação in vitro. Além disso, um estudo recente também demonstrou a viabilidade de expandir o TIL funcional a partir de amostras de tumores pancreáticos [ 36 ].
Excesso (não requerido para análise patológica), os adenocarcinomas pancreáticos ressecados cirurgicamente recebidos em laboratório para geração de TIL eram caracteristicamente pequenos em tamanho, restringindo o suprimento de material de partida crucial para cultivar TIL de fragmentos de tumor. Foi anteriormente relatado que a densidade de linfócitos infiltrantes também é inferior em tumores GI quando comparados ao melanoma, levando a um aumento do tempo necessário para a expansão [ 28].]. Essas desvantagens são importantes a considerar, uma vez que uma preocupação central da ACT é o atraso necessário entre a cirurgia e a infusão. O tratamento prévio de pacientes, como com terapias com inibidores do ponto de verificação imunológico, antes da ressecção cirúrgica para o enriquecimento de tumores para populações linfocitárias específicas, deve ser investigado como um meio de superar essa limitação.
Células T localizadas no microambiente do tumor pancreático têm sido caracterizadas como intrinsecamente e extrinsecamente suprimidas, freqüentemente atribuídas à presença de T regs [ 14 , 37 , 38 ]. É importante ressaltar que, no atual estudo após a expansão em IL-2, as células TIL pancreáticas foram predominantemente células T ativadas, antes e depois do REP, e apresentaram marcadores de experiência antigênica, incluindo CD69 e CD45RO. Além disso, demonstramos que altas doses de IL-2 in vitro não polarizaram as culturas TIL pancreáticas para um fenótipo T reg , mas podem ter influenciado o fenótipo ativado observado. A relativamente alta T ef a T regA razão foi estabelecida, o que é considerado crítico para a vigilância imunológica eficaz dos tumores [ 37 , 38 ]. Este resultado destaca a importância da liberação de TIL pancreático de seu microambiente tumoral naturalmente inibitório e apóia a noção de que o TIL pancreático tem um fenótipo de plástico que pode ser polarizado em direção a uma função efetora. Portanto, nossos dados sobre TIL pancreático confirmam relatos anteriores de que TIL de tumores GI se assemelham ao estado ativado de TIL derivado de melanomas [ 28 ].
Descobrimos que a molécula inibitória PD-1 foi expressa em níveis substanciais em TIL pancreática minimamente cultivada, dentro da faixa de expressão de PD-1 relatada em TIL de outros tumores GI [ 28 ]. A presença de PD-1, que se acredita ser preferencialmente expressa em um repertório abrangente de TIL reativa a tumor, confirmou que essas células T eram experientes em antígenos e demonstraram a necessidade de isolá-las de fontes potenciais de inibição de ligantes [ 23 , 30]. Além disso, fomos capazes de capitalizar a expressão da superfície da PD-1 através da adição de um anticorpo bloqueador à cultura TIL e observamos um aumento substancial na expansão da TIL. Estes dados sugerem que interromper a sinalização da PD-1 durante a cultura TIL ex vivo pode expandir seletivamente as células T reativas ao tumor, mas isso requer investigação adicional antes que qualquer conclusão possa ser tirada. Adicionalmente, a expressão de PD-1 na TIL é conhecida como sendo transitória durante a cultura com IL-2, como também observamos (Fig. 2b ), potencialmente destacando a janela limitada para empregar essa estratégia para aumentar o crescimento de TIL [ 30 ].
Nós também investigamos os efeitos de um anticorpo agonista 4-1BB na sua capacidade de melhorar o rendimento de TIL pancreático, como já observamos anteriormente em TIL derivado de melanoma [ 39 ]. A TIL expandida em meio suplementado com anti-4-1BB demonstrou um aumento significativo no número absoluto de TIL produzido por fragmento. Além disso, estas TIL eram predominantemente células T CD8 + com uma diferença de 32 vezes no rendimento desta população em comparação com as culturas de controlo. Acredita-se que, como TIL positivas para 4-1BB correspondam às células T submetidas ao acoplamento TCR recente, é possível que essa expansão seletiva de CD8 +os linfócitos representam a população de TIL residentes em tumores específicos para antígenos tumorais expressos na superfície do adenocarcinoma pancreático [ 28 ].
É amplamente aceito que as células T CD8 + são instrumentais para uma resposta antitumoral, mas o envolvimento das células T CD4 + é muito menos claro e potencialmente prejudicial [ 31 , 40 , 41 ]. Num estudo murino, a presença de células T CD4 + produtoras de TNFα e IL-17 no cancro do pâncreas foi associada a doença relativamente agressiva [ 42 ]. Por esta razão, optamos por isolar o CD8 +TIL pancreático para uso como efetores em ensaios de reatividade tumoral. Uma dificuldade importante para a tradução da terapia TIL em pacientes pancreáticos é a falta de tumor autólogo para a avaliação da reatividade específica do tumor. Isto exigiu uma dependência de linhas tumorais pancreáticas HLA combinadas, conhecidas por sua relativa falta de antígenos compartilhados, como alvos TIL [ 35 ]. É importante ressaltar que fomos capazes de demonstrar uma resposta imunológica restrita e significativa, HLA, a alvos tumorais pareados usando essa estratégia. Estudos anteriores mostraram que uma resposta imune contra antígenos de câncer de pâncreas compartilhados pode ser eliciada, e nossos resultados confirmam que TIL expandido de tumores pancreáticos são funcionais quando re-estimulados com alvos tumorais HLA-correspondentes [ 7 , 13 , 43- 48 ]. Um estudo recente demonstrou que a TIL expandida a partir de tumores pancreáticos reconheceu antígenos de tumores pancreáticos compartilhados, incluindo NY-ESO-1, survivina e mesotelina [ 36 ]. Enquanto a reatividade aos antígenos compartilhados pode ser medida em um subgrupo de amostras TIL pancreáticas, foi demonstrado que pacientes com malignidades GI metastáticas têm mutações únicas, e as respostas de células T antitumorais são direcionadas para neoantígenos específicos para cada paciente individual [ 35 ]. Mais adiante, será importante desenvolver métodos eficazes para estabelecer alvos tumorais autólogos. Isto também permitiria uma avaliação mais completa do compartimento TIL, incluindo CD4 + TIL, que foram previamente demonstradas como reconhecendo o tumor autólogo [ 41 ] .].
Conclusões
Os TIL foram prontamente isolados e expandidos a partir de tumores pancreáticos e caracterizados por um fenótipo predominantemente ativado, ao invés do fenótipo supressor previamente relatado estar presente no microambiente tumoral. A capacidade do TIL pancreático para reagir à estimulação do antígeno do tumor indica que esta população tem a capacidade de efetuar uma resposta específica do tumor. Portanto, o ACT com TIL é uma estratégia terapêutica que deve ser investigada para o adenocarcinoma pancreático, um câncer com alta letalidade e opções limitadas de tratamento.
Métodos
Para cultura
Tumores pancreáticos foram picados em ~ 1 mm 3fragmentos, colocados em placas de 24 poços com 2 ml de meio TIL contendo IL-2 e TIL pancreático foram deixados a extravasar do tecido. Se disponível, o excesso de tecido foi fisicamente e enzimaticamente digerido como descrito abaixo. Em alternativa, utilizaram-se placas de 48 poços seguindo o mesmo procedimento, utilizando 1 ml de meio TIL e IL-2. TIL foram expandidos in vitro por 3-6 semanas em 6000 UI / mL de IL-2 (Proleukin, Novartis, Emeryville, CA) por mL de meio TIL completo (TIL-CM) consistindo de RPMI 1640, L-glutamina 2,05 mM (HyClone , Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 10% de soro AB humano inactivado pelo calor (Omega Scientific, Tarzana, CA), 55 μM de 2-mercaptoetanol (Invitrogen), 50 μg / mL de gentamicina (Invitogen), 100 UI / mL de penicilina , 100 µg / mL de estreptomicina e tampão HEPES 10 mM (Mediatech, Manassas, VA) em placas de 24 ou 48 poços. Metade dos meios foi substituída a cada 2 a 3 dias ou os poços foram separados quando 80% confluentes. Para a geração TIL na presença de anticorpos coestimulatórios, as TIL foram propagadas como acima com a adição de um anticorpo antagonista PD-1 humano (Nivolumab, 10 µg / mL) ou com um anticorpo agonista humano 4-1BB (Urelumab, 10 µg / mL no início, seguido pelo suplemento continuado com 1 µg / mL em cada alimentação ou separação como acima) generosamente fornecido pelos drs. Alan Korman e Maria Jure-Kunkel (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ). seguido por suplemento continuado com 1 μg / mL em cada alimentação ou divisão como acima) generosamente fornecido pelos Drs. Alan Korman e Maria Jure-Kunkel (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ). seguido por suplemento continuado com 1 μg / mL em cada alimentação ou divisão como acima) generosamente fornecido pelos Drs. Alan Korman e Maria Jure-Kunkel (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ).
Protocolo de expansão rápida (REP)
Em um frasco de GREX10 (Wilson Wolf), 5,0 × 10 5 TIL pancreáticos foram estimulados com 30 ng / mL de anti-CD3 humano (OKT3, Ortho Pharmaceutical, Raritan, NJ) na presença de 1,0 x 10 8 irradiados (5000 rad) alógenos Células de alimentação PBMC. Os TIL foram cultivados em 20 mL de 50% de REP Media I (descrito abaixo) e 50% de AIM V (Invitrogen) suplementado com 3000 IU / mL de rhIL-2. No dia 4, 10 mL do mesmo meio foi adicionado ao frasco de GREX. No dia 7, as culturas foram contadas e separadas conforme necessio e o volume remanescente no frasco foi cheio com meio AIM V suplementado com 3000 IU / mL de rhIL-2. Após 14 dias, as TIL foram coletadas e contadas e descansadas em condições pré-REP antes de futuras análises.
Mini protocolo de expansão rápida (mini-REP)
Em um frasco T25, 1,43 x 10 5 pancreático TIL foram estimuladas com 30 ng / mL de anticorpo anti-CD3 (OKT3, Ortho Pharmaceutical, Raritan, NJ), na presença de 2,9 x 10 7irradiadas (5000 rad) células de alimentação de PBMC alogénicas. Os TIL foram cultivados em REP Media I composto por RPMI 1640, 2,05 mM de L-glutamina (HyClone, Thermo Fisher Scientific), 10% de soro AB humano inactivado pelo calor (Omega Scientific), 55 μM de 2-mercaptoetanol (Invitrogen) e 10 mM Tampão HEPES (Mediatech). No dia 5, 70% dos meios foram substituídos por REP Media II constituído por uma mistura 1: 1 (v: v) de REP Media I e AIM V (Invitrogen). O meio foi suplementado com 6000 UI / mL de rhIL-2 nos dias 2 e 5 do REP de 8 dias. Este protocolo foi também implementado em frascos T75 a exactamente triplicar as contagens de células e reagentes anteriormente mencionados.
Expansão do CD8 + TIL
As células T CD8 + foram enriquecidas a partir de TIL propagada por depleção de células CD4 + com um estojo de isolamento de CD8 + humano (Miltenyi Biotech, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Os CD8 + TIL foram expandidos durante 8 dias utilizando um mini-REP em frascos T25.
Citometria de fluxo
Tecidos tumorais em excesso não utilizados para geração de TIL foram digeridos fisicamente com bisturis e enzimaticamente com meio contendo colagenase tipo IV (1 mg / mL), DNase tipo IV (30 U / mL) e hialuronidase tipo V (100 μg / mL) (Sigma ). As suspenss de cula ica foram tensas e contadas via exclus de azul de tripano, seguida por criopreservao para anise futura. As digestões de tumor e TIL foram coradas em vários pontos no processo de expansão usando o seguinte: anticorpos conjugados APC, PE, FITC, PECy7, PerCpCy5.5 e AlexaFluor700: CD3, CD4, CD8, CD25, FoxP3, CD69, PD-1, GITR, 4-1BB, CTLA-4, CCR7, CD45RO, CD27, CD28 e CD122 (BD Biosciences, San Jose, CA;, eBioscience, La Jolla, CA; ou R & D Systems, Minneapolis, MN). Todos os painéis continham a mancha de células mortas LIVE / DEAD Aqua ou LIVE / DEAD Near-IR (Invitrogen). A coloração de Foxp3 intracelular foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (eBioscience). Os dados foram adquiridos num citómetro de fluxo LSRII (BD Biosciences) e analisados utilizando o software FlowJo (TreeStar, Inc.).
Ensaio funcional de CD107a e IFN-γ
Uma análise baseada em citometria de fluxo da função de TIL foi concebida para detectar a expressão da membrana de CD107a e a expressão de IFN-γ intracelular. Resumidamente, TIL foram estimulados a 37 ° C durante a noite a uma concentração de 5 x 10 5células / mL na presença de 25 ng / mL de acetato miristato de forbol (PMA) e 0,5 μM de ionomicina. Após 90 min de estimulação, adicionou-se CD107a conjugado com APC ou o seu isotipo IgG1k (BD Biosciences). Brefeldina A, a 1 μg / mL, (Sigma Aldrich) e monensina, a 0,067% (v / v), (GolgiStop, BD Biosciences) foram adicionados uma hora depois. Após 18 h, as células foram lavadas uma vez com Tampão de Coloração (PBS contendo 0,05% (v / v) de soro Humano AB), então coradas à superfície (4ºC por 30 min) com antiinflamatórios conjugados AlexaFluor 700, PECy7 e PerCpCy5.5 -CD3, CD4 e CD8 (BD Biosciences), respectivamente. O corante LIVE / DEAD Aqua (Invitrogen) foi incluído como corante de viabilidade celular. As culas foram lavadas uma vez com Tamp de Colorao e depois fixadas e permeabilizadas com BD Cytofix / Cytoperm durante 20 min a 4 e lavadas duas vezes com BD Perm / Wash (BD Biosciences). A colorao intracelular de anti-IFN-? Conjugado com FITC (BD Biosciences) ocorreu a 4 durante 30 min, seguido de uma lavagem com BD Perm / Wash. As células foram armazenadas em paraformaldeído a 0,5% (Thermo Fisher Scientific) a 4 ° C no escuro. Todas as amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences) dentro de 48 horas e analisadas usando o software FlowJo (TreeStar, Inc.)
Ensaios de co-cultura
Effector TIL foi co-cultivado em TIL CM em placas de fundo redondo de 96 poços (5 × 10 4 TIL) a uma proporção de 1: 1 com alvos de linha celular de cancro pancreático durante 24 ou 48 h. As linhas celulares MiaPaca-2, Panc-1, CFPAC-1 e HPAF-II foram obtidas da ATCC e cultivadas de acordo com as directrizes do fabricante. Os sobrenadantes foram recolhidos e a reactividade das linhas celulares de TIL pancreico a de cancro pancreico emparelhadas com HLA foi determinada seguindo as instrues do fabricante para o ensaio IFN-? ELISA (IFN-? Quantikine ELISA Kit Humano, R & D Systems). A densidade óptica de cada poço foi medida a 450 nm e a concentração de IFN-y foi calculada a partir da curva padrão.
Análise de viabilidade
A TIL foi contada e avaliada quanto à viabilidade usando o software ViaCount Reagent e ViaCount da Guava de acordo com as instruções do fabricante e analisadas no sistema Guava PCA (Guava Technologies, Hayward, CA). Alternativamente, os TIL foram contados por exclusão de azul de tripano num hemocitómetro.
Análise estatística
Os dados representados como gráficos de dispersão mostram pontos de dados individuais do paciente ou fragmentos onde indicado, bem como barras de erro representando os valores médios e o desvio padrão (SD) ou erro padrão da média (SEM). Os valores de P foram determinados usando o software GraphPad Prism pelo teste t de Wilcoxon, teste de Wilcoxon, teste de Mann Whitney, ou teste t de Student não pareado, quando indicado.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Núcleo de Citometria de Fluxo, Instalação do Núcleo Tecidual e Programa de Cuidados Totais contra o Câncer no Centro de Câncer Moffitt e, em parte, pelo Subsídio de Apoio ao Centro de Câncer P30 CA076292 do Instituto Nacional do Câncer.
Financiamento
O apoio a este projeto foi fornecido pelo NCI-5K23CA178083 (AAS) e subvenções do Ocala Royal Dames para a Cancer Research e Swim Across America e um Contrato de Pesquisa Patrocinada com a Lion Biotechnologies, Inc.
Disponibilidade de dados e materiais
Não aplicável.
Contribuição dos autores
MH e HL realizaram os experimentos e redigiram o manuscrito. MM, BC e JP consentiram pacientes e coletaram tecidos tumorais. SPT e AAS conceberam o estudo, projetaram os experimentos e coordenaram e ajudaram a redigir o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Informação dos autores
Não aplicável.
Interesses competitivos
Os autores declaram não ter interesses conflitantes.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Aprovação ética e consentimento para participar
Pacientes com câncer de pâncreas foram atendidos no Centro de Pesquisa e Câncer H. Lee Moffitt e os tumores foram obtidos por consentimento informado para um protocolo aprovado pelo IRB. Todas as pesquisas envolvendo seres humanos foram realizadas de acordo com a Declaração de Helsinque e foram aprovadas pelo IRB na University of South Florida.
Abreviaturas
| AJA | Terapia Celular Adotiva |
| GI | Gastrointestinal |
| PMA | Acetato de miristato de forbol |
| Escola primária | Desvio padrão |
| SEM | Erro padrão da média |
| TO | Linfócitos infiltrantes tumorais |
| REP | Protocolo de expansão rápida |
Arquivo adicional
Arquivo adicional 1: Figura S1. (286K, pptx)
TIL pancreático cultivado na presença de anticorpo bloqueador de PD-1 demonstrou reatividade tumoral aumentada. A TIL expandida com anti-PD-1 ou o isotipo de controlo foram co-cultivados com linhas tumorais HLA-A combinadas (negras) e não coincidentes (vazias). A liberação de IFN-gama foi avaliada por ELISA após 24 he relatada como média ± DP ( n = 1). Figura S2 Pré-REP e pós-REP Pancreatic TIL são fenotipicamente semelhantes. Os TIL pancreáticos foram expandidos a partir de fragmentos em IL-2 e depois submetidos ao REP completo de duas semanas. TIL foram corados para os marcadores de superfície indicados, além de CD3, CD4, CD8 e um corante de viabilidade. Os dados representam percentuais positivos da porta-mãe CD4 (A) ou CD8 (B) como média ± DP ( n = 3). (PPTX 285 kb)
Informação do Colaborador
MacLean Hall, Email: gro.ttiffom@llah.naelcam .
Hao Liu, e-mail: moc.rezifp@uil.oah .
Mokenge Malafa, Email: gro.ttiffom@afalam.egnekom .
Barbara Centeno, e-mail: gro.ttiffom@onetnec.arabrab .
Pamela J. Hodul, Email: gro.ttiffom@ludoh.alemap .
José Pimiento, Email: gro.ttiffom@otneimip.esoj .
Pilon-Thomas Lowland em Shari, e-mail: grottiffomsamohtnolipirahs .
Amod A. Sarnaik, Email: gro.ttiffom@kianras.doma.
Informação do artigo
Autor correspondente.