O ácido nicotínico Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NAADP) estimula a liberação de cálcio a partir de reservas ácidas, como os lisossomos, e é um segundo mensageiro de mobilização de cálcio altamente potente. O NAADP desempenha um papel importante na sinalização de cálcio no coração em condições basais e após estresse β-adrenérgico. No entanto, a interação espacial das reservas ácidas com outras partes do aparato de sinalização de cálcio nos miócitos cardíacos é desconhecida. Nós apresentamos evidências de que os lisossomos estão intimamente associados com o retículo sarcoplasmático (RS) nos miócitos ventriculares; uma separação mediana de 20 nm em microscopia eletrônica 2D e 3.3 nm em tomografia eletrônica 3D indica um genuíno microdomínio de sinalização entre essas organelas. A análise de Fourier de lisossomas imunomarcados sugere um padrão sarcomérico (comprimento de onda dominante de 1,80 μm). Além disso, Nós mostramos que os lisossomas formam associações próximas com mitocôndrias (separação mediana de 6,2 nm em estudos tridimensionais) que podem fornecer uma base para o recém-descoberto papel do NAADP na morte celular induzida por reperfusão. A hipótese do gatilho para a ação do NAADP propõe que a liberação de cálcio das reservas ácidas atua subseqüentemente para aumentar a liberação de cálcio do RS. Este trabalho fornece evidências estruturais nos miócitos cardíacos para indicar a formação de microdomínios entre os estoques de cálcio ácido e SR, apoiando as interpretações emergentes da fisiologia e farmacologia do NAADP no coração. A hipótese do gatilho para a ação do NAADP propõe que a liberação de cálcio das reservas ácidas atua subseqüentemente para aumentar a liberação de cálcio do RS. Este trabalho fornece evidências estruturais nos miócitos cardíacos para indicar a formação de microdomínios entre os estoques de cálcio ácido e SR, apoiando as interpretações emergentes da fisiologia e farmacologia do NAADP no coração. A hipótese do gatilho para a ação do NAADP propõe que a liberação de cálcio das reservas ácidas atua subseqüentemente para aumentar a liberação de cálcio do RS. Este trabalho fornece evidências estruturais nos miócitos cardíacos para indicar a formação de microdomínios entre os estoques de cálcio ácido e SR, apoiando as interpretações emergentes da fisiologia e farmacologia do NAADP no coração.

A visão tradicional de que os lisossomos funcionam apenas como um terminal das vias celulares catabólicas tem sido desafiada recentemente por várias linhas de evidências mostrando que essa pequena organela ácida também desempenha um papel central na função celular via sinalização do cálcio lisossomal ¹ . A sinalização do cálcio lisossomal é uma via pouco estudada no coração, que tem sido implicada nas respostas adrenérgicas dos miócitos atriais ² e ³ ventriculares . O ácido nicotínico adenina dinucleotídeo fosfato (NAADP) é um segundo mensageiro que induz a liberação de cálcio de reservas ácidas, como o lisossoma e os grânulos de reserva relacionados ao lisossomo no ovo de ouriço-do-mar ⁴. A importância que essa molécula sinalizadora desempenha na mobilização do cálcio em muitas espécies de animais e plantas tem sido estabelecida nas últimas décadas ⁵ . Foi demonstrado que a liberação de cálcio mediada por NAADP está envolvida em uma gama extremamente ampla de processos de sinalização celular, incluindo fertilização ⁶ , secreção de insulina e respostas ^7 , 8 e diferenciação neuronal ⁹ . Além disso, trabalhos recentes têm implicado o caminho na infectividade do vírus Ebola ¹⁰ .

A cada batimento cardíaco, o acoplamento excitação-contração converte a passagem da excitação elétrica através do miocárdio para a contração por meio de um rápido aumento e subsequente recuperação do cálcio citosólico, o chamado "cálcio transitório". O cálcio que entra no citosol através de canais de cálcio tipo L controlados por voltagem é detectado na face citosólica dos receptores de rianodina (RyR), que então se abrem, levando à liberação massiva de cálcio do retículo sarcoplasmático (SR). Essa amplificação do estoque de cálcio intracelular da célula é conhecida como liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) e é terminada pelo fechamento dos receptores de rianodina e pela remoção do cálcio do citosol de volta para o RS. Essa depuração ocorre através do bombeamento ativo para a SR pela ATPase de cálcio do retículo sarco-endoplasmático (SERCA) e troca passiva para fora da célula através do trocador de cálcio de sódio (NCX). A atividade da SERCA é modulada pelo fosfolambam (PLB) que se liga e inibe a SERCA sob condições de repouso. A fosforilao de PLB alivia esta inibio, acelerando assim a eliminao do ccio do citosol e aumentando o teor de ccio SR.

Vários canais de cálcio também residem na membrana lisossomal e estudos exploraram o papel desses canais de cálcio lisossomal em processos celulares fisiológicos e patológicos ¹¹ . A ação do NAADP em canais de dois canais (TPC2) na membrana lisossômica é o mecanismo mais provável pelo qual ocorre a liberação de cálcio mediada por NAADP, isso foi demonstrado em estudos isolados de membrana e organelas e vários tipos de tecido ^{10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} . De fato, o NAADP não produz mais uma resposta nos miócitos cardíacos após a abolição do H⁺ gradiente necessário para carregamento de cálcio lisossômico ²⁰ e células derivadas de camundongos knockout de TPC2 não respondem à aplicação de NAADP ³ . Estudos de bloqueio mediados por anticorpos têm sido usados ​​para propor o Potencial do Receptor Transiente Mucolipina 1 (TRPML1) como o canal permeável ao cálcio responsável pela liberação de cálcio mediada por NAADP ²¹ . Em células SKBR3, esses canais co-imunoprecipitam, no entanto, a superexpressão de TRPML1 não teve efeito sobre as respostas de NAADP, enquanto a superexpressão de TPC2 foi associada a um aumento de sinais de cálcio mediados por NAADP ¹⁸ . Além disso, as células acinares pancreáticas sem a proteína TRPML1 não apresentam diferença nas oscilações de cálcio evocado por NAADP ¹⁸. Alternativamente, foi sugerido que o NAADP pode agir diretamente no RyR para causar liberação de cálcio ^22 ,23 .

Trabalhos recentes demonstraram que a via de sinalização do NAADP tem um papel fisiológico vital no coração ^{2 , 3 , 20 , 24} . A liberação de NAADP em cardiomiócitos atriais ou ventriculares resulta em um aumento dos efeitos transitório de cálcio, inotrópico positivo (contração aumentada) e lusitrópico (relaxamento aumentado) e aumento da carga de cálcio do RS ²⁰ . Por outro lado, a inibição aguda da via que utiliza a bafilomicina A1 para interromper a função de reserva ácida ou o Ned-19, um antagonista específico do receptor de NAADP ²⁵ , causa uma redução no transitório de cálcio. O uso de bafilomicina-A1, Ned-19 ou nocaute genético da proteína TPC2 ( Tpcn2 ^{- / -}) resulta em um enfraquecimento significativo das respostas à isoprenalina em termos de efeito transitório e inotrópico do cálcio, sugerindo que o NAADP / TPC2 desempenha um papel importante na transdução da estimulação β-adrenérgica ³ . Além disso, camundongos Tpcn2 ^{- / -} são parcialmente protegidos das arritmias cardíacas e da hipertrofia ventricular associada ao estresse β-adrenérgico crônico ³ , e tanto o knockout de TPC2 ³ quanto a inibição da via NAADP ²⁴ reduzem significativamente a atividade espontânea associada à β-adrenérgica aguda estresse.

Embora seja possível que a liberação de cálcio das reservas ácidas e da RS seja simplesmente aditiva, várias linhas de evidência sugerem que um mecanismo de amplificação está presente. O aumento da carga de cálcio do RS foi observado após a liberação de NAADP ^2 , 20 , e o aumento na amplitude transitória do cálcio que ocorre devido ao NAADP pode ser bloqueado por inibidores da proteína quinase dependente de calmodulina tipo II (CaMKII) - sugerindo que esta serina / treonina quinase é necessária para a regulação da amplitude transitória do cálcio pelo NAADP ³. O cálcio liberado do lisossomo também pode promover diretamente o CICR a partir do RyR, ou resultar em aumento da liberação de cálcio do RS indiretamente, talvez por meio da fosforilação do receptor de rianodina (RyR) por CaMKII. Se as alterações na atividade do RyR fossem o único mecanismo, não se esperaria uma carga elevada de cálcio do RS. É possível, no entanto, que os efeitos do NAADP no coração envolvam simultaneamente a recaptação de cálcio e os mecanismos de liberação de cálcio.

Foi previamente demonstrado que os efeitos da liberação de cálcio mediada por NAADP são específicos para o RS e não afetam as correntes de cálcio do tipo L na membrana da superfície ² . Nossas evidências anteriores sugerem que o cálcio liberado do lisossoma em resposta à ação do NAADP no TPC2 altera a SERCA e / ou o RyR via modulação ^2 , 20 da atividade da CaMKII ³ . Um pré-requisito óbvio para essa hipótese é uma organização espacial subcelular que leva as membranas de organelas ácidas, como endossomas e lisossomos, a uma aposição próxima do RS para permitir que a liberação de cálcio de reservas ácidas aumente as concentrações locais o suficiente para modular CaMKII, SERCA, PLB e / ou atividade de RyR do SR.

A existência de regiões celulares entre duas membranas que estão próximas (tipicamente com menos de 30 nm de separação) favorece a congregação de proteínas de sinalização de cálcio em tais espaços restritos, e essas regiões são funcionalmente referidas como microdomínios ou nanojunções ^26 , 27 . Estas regiões foram por vezes referidas como locais de contato de membrana (MCS) ²⁷ . Essas MCS permitem a segregação de reações bioquímicas às vezes incompatíveis em compartimentos específicos com microambientes personalizados e formam a base anatômica para a sinalização funcional de cálcio ^{27 , 28 , 29, 30}. Tais microdomínios entre os lisossomas e o RE foram recentemente descritos no músculo liso da artéria pulmonar ^{31 , 32 , 33} e fibroblastos humanos ^34.. Aqui, olhamos para as associações íntimas dos lisossomas no coração, no contexto do que já se sabe sobre a sinalização do NAADP neste tecido. Examinamos a localização e a organização dessas organelas ácidas em relação às membranas de sinalização de cálcio, como os tubos SR e T, usando tanto a microscopia eletrônica 2D quanto a reconstruções tomográficas eletrônicas 3D. Esta informação é importante para restringir modelos funcionais dos papéis de sinalização de cálcio do NAADP no coração em repouso e é relevante para a contribuição da sinalização de NAADP na resposta β-adrenérgica. Além disso, investigamos a proximidade dos lisossomas às mitocôndrias, à luz de evidências recentes que apóiam o papel da sinalização de NAADP via TPC1 na lesão de isquemia / reperfusão ³⁵ .

Microscopia Eletrônica de Lisossomos Identifica Nanojunções Potenciais para Sinalização de Cálcio em Miócitos Ventriculares Cardíacos

A fim de investigar a proximidade das membranas lisossômicas com outras organelas subcelulares, realizamos microscopia eletrônica de transmissão (TEM) em miócitos ventriculares isolados de coelhos e tecido ventricular fixo. Um total de 69 lisossomas foi identificado em imagens de TEM de células ventriculares de coelho. Embora sua aparência fosse heterogênea, eles poderiam ser identificados por características morfológicas características ³⁶ . A matriz luminal lisossômica é delimitada por uma membrana de dupla camada, e observamos matrizes com densidades elétricas variáveis, semelhantes aos lisossomos claro e escuro descritos anteriormente. As matrizes intra-lisossomais eram às vezes uniformes e apenas ligeiramente mais elétron densas que o citoplasma, e em outros casos havia uma diferença significativa na densidade e uniformidade (ver exemplo Fig. 1Apara uma micrografia contendo os dois tipos). Isso pode estar relacionado à idade dos animais, que determina o número de corpos densos e inclusões de lipofuscina ²⁶ , bem como algumas contribuições de métodos experimentais (como métodos de fixação ou pós-coloração de cortes) ³⁷.

Verificou-se que os lisossomas medidos (n = 69) tinham um eixo médio longo de 383 nm (306-580 nm) e um eixo médio curto de 290 nm (220-455 nm). Isso está de acordo com as dimensões lisossômicas relatadas recentemente nas células do músculo liso da artéria pulmonar ³² . Já foi observado que a diferenciação entre endossomos e pequenos lisossomas é difícil e que um diâmetro limiar de 200 nm deve ser usado para definir um lisossoma ³² . A aplicação deste critério aos dados aqui apresentados resulta num total de 61 lisossomas visualizados com um eixo médio longo de 414 nm (325-598 nm) e eixo curto de 320 nm (248-483 nm). Um resumo desses dados é apresentado na Figura 1B.. Todas as análises posteriores foram realizadas sem a aplicação deste critério. Outras estruturas observadas em nossa análise de MET incluíram corpos multivesiculares, gotículas lipídicas e autofagossomos, os quais não foram incluídos em nossa análise (veja a Figura Suplementar 1 para exemplos).

A microscopia eletrônica de transmissão bidimensional (TEM) provavelmente fornecerá uma superestimação da distância entre duas estruturas, devido ao fato de que o plano e o ângulo da seção provavelmente não incluirão sempre a menor distância entre eles. No entanto, imagens TEM de miócitos ventriculares de coelho isolados demonstraram que a maioria dos lisossomas (56/69) estava intimamente associada com a membrana do SR (ver exemplos da Fig. 2A e B ). A distância mediana entre estas 56 organelas e a peça mais próxima de SR visível foi de 20 nm (13–24 nm). Destes, 48 ​​estavam perto o suficiente (<30 nm de separação) para definir como um MCS ³⁸ . Dados populacionais são apresentados na Fig. 2C .

Em seguida, medimos as distâncias aparentes mais curtas entre os lisossomas e o túbulo-T mais próximo e a linha-Z, onde estes também eram visíveis nas micrografias usadas acima. Um exemplo representativo incluindo tanto os túbulos T como as linhas Z pode ser visto na Fig. 3A . Para ambas as estruturas, a distância mais próxima era muito maior que a membrana SR mais próxima; 318 nm (176-529 nm) para as linhas Z (n = 45) e 163 nm (123-870 nm) para os túbulos T (n = 24; One-way ANOVA com correção de Sidak, P <0,0001 para L-SR distância vs L-TT distância e também P <0,0001 para a distância L-SR vs distância LZ). As distribuições foram positivamente distorcidas, mas não de natureza binomial ( Fig. 3B e Crespectivamente). Em 23 casos, os lisossomos foram vistos com SR adjacente, e um T-túbulo também pôde ser visto na mesma micrografia. Em todos os casos, a distância para o SR foi menor que a distância até o T-tubule.

Além de estar em estreita proximidade com a membrana do SR, havia muitos exemplos em que os lisossomos eram vistos em contato próximo com as mitocôndrias (n = 51). Destes 51 casos, 42 também estavam associados à RS e, portanto, incluídos nas análises acima. As distâncias entre um lisossomo e a mitocôndria mais próxima variaram consideravelmente; alguns eram tão próximos que não era possível resolver uma lacuna entre a membrana lisossomal e a membrana mitocondrial ( Fig. 4A). Como é possível que os lisossomas que tocam as mitocôndrias possam estar envolvidos na autofagia, notamos sua existência, mas não os incluímos em análises numéricas. Embora a distância máxima medida entre um lisossoma e a membrana mitocondrial mais próxima fosse 1419 nm, a maioria das organelas neste conjunto de dados estava intimamente associada com mitocôndrias (exemplos representativos apresentados na Fig. 4B ) e apenas cinco estavam a mais de 75 nm de distância vizinho mitocondrial mais próximo. A distância mínima mensurável foi de 7,1 nm. Após a remoção de outliers estatísticos (ROUT, Prism 6), a distância lisossomo-mitocondrial mediana foi de 17 nm (14-37 nm, n = 41). Os dados de resumo são apresentados como um histograma de frequência juntamente com a análise de L-SR para comparação ( Fig. 4C ).

Os métodos convencionais de TEM utilizando maiores concentrações de glutaraldeído e seguidos por incorporação de resina Spurr permitem uma melhor visualização das membranas. Embora este método seja ideal para imagear membranas intracelulares, não permite a marcação imuno-ouro de proteínas como o glutaraldeído de pontes hidroxil-metileno entre grupos terminais reativos de cadeias proteicas adjacentes, o que pode diminuir a imunorreatividade ou acessibilidade a sítios imunorreativos. Por essa razão, usamos seções do tecido LR White embebido (fixação de tecido com 4% de PFA e 0,1% de glutaraldeído) para realizar a marcação imuno-ouro da proteína específica de lisossomo LAMP-2. Figura suplementar 2apresenta marcação com imuno-ouro de LAMP-2, como marcador lisossomal, em tecido ventricular de ratinho branco incorporado em LR. As organelas marcadas com ouro são vistas em estreita proximidade com as prováveis ​​membranas de RE e mitocôndrias, consistente com as nossas análises numéricas acima.

Tomografia Eletrônica Tridimensional de Lisossomos Confirma Estruturas Extensivas Adequadas para Forma de Microdomínios de Sinalização

As técnicas de imagem 2D sofrem de superestimação sistemática das medidas de proximidade. Portanto, realizamos imagens e análises de tomografia eletrônica 3D para obter uma imagem precisa da inter-relação espacial das organelas dentro da célula e para identificar as distâncias mínimas verdadeiras entre as membranas lisossomais e outras estruturas de sinalização de cálcio subcelular.

A Figura 5 mostra exemplos representativos de planos de corte individuais (A & C) e reconstruções 3D de lisossomos e organelas circundantes (B & D). Após a remoção de outliers, consistente com o método de análise do nosso estudo 2D TEM, a distância mediana (largura do intervalo) entre os lisossomos e o RS foi de 3,3 nm (ver Tabela 1 para detalhes sobre as distâncias mínimas até as mitocôndrias e os túbulos-T). Uma reconstrução de vídeo em conjunto com vistas multi-ângulo da célula na Fig. 5A e B está disponível na informação suplementar ( Vídeo Suplementar 1 ).

Microscopia Confocal em Células Fixas Identifica Periodicidade Sarcomérica na Expressão de Proteína LAMP-2 em Miócitos Ventriculares Cardíacos

We next utilised immunocytochemical staining of isolated rabbit ventricular myocytes to investigate whether acidic calcium stores exhibit a regular spatial organisation at the micro-scale within whole ventricular myocytes. Several anti-TPC2 antibodies were tested, and all showed non-specific staining in TPC2 knock-out mice (data not shown). We concluded that, at present, no commercially-available antibody is sufficiently robust for immuno-localisation of the TPC2 channel. We therefore stained for LAMP-2, a lysosomal membrane protein with roles in organelle stability, chaperone-mediated autophagy and lysosomal motility. LAMP-2 staining revealed a punctate distribution (Fig. 6A and E). Staining against type-2 ryanodine receptor (RyR2) or phospholamban (PLB) revealed the expected regular appearance (for example Fig. 6B and F respectively)³⁹: both of these labels were seen as striations running across the width of the cell, perpendicular to its long axis. To determine any non-specific labelling of secondary antibodies control cells with no primary antibody, incubated with anti-rabbit or anti-mouse secondaries alone were imaged and found to give no detectable signal (data not shown).

The punctate staining of lysosomes in immunocytochemistry (eg Fig. 6A and D) has not previously been studied to assess the possibility that they are arranged in non-random patterns. Fourier analysis of fluorescence intensity measurements, summed perpendicularly to the cells’ long axis, was used to determine the dominant frequency of the signal corresponding to each protein in order to determine whether lysosomes occur with any periodicity and how this relates to other proteins of the SR. An example of a RyR2 and LAMP-2 labelled cell and another of a PLB and LAMP-2 labelled cell with analyses for these images are given in Fig. 6. Confocal images were first rotated so that striations ran vertically (Fig. 6B and F) and total fluorescence was calculated for each vertical column of pixels (Fig. 6C and G), such that in a 100 × 100 pixel image the intensities of all 100 pixels positioned vertically at the horizontal position of x = 1 are added together to give a fluorescence intensity in arbitrary units, and similar summations are made for all horizontal positions up to x = 100; these fluorescence values are plotted against horizontal distance along the cell perpendicular to the direction of striations. Fourier analysis was then carried out on the resulting intensity vs distance waveforms to ascertain the dominant frequency of each signal (Fig. 6D and H). Fourier analysis of a total of 22 cells (18 RyR2 vs LAMP-2 and 4 PLB vs LAMP-2) revealed a strong positive correlation between the dominant frequencies for RyR2 and PLB when plotted against LAMP-2 (r = 0.72, Fig. 6I). In the RyR2-labelled cell displayed, dominant frequencies for both RyR2 and LAMP-2 were 0.56 signal peaks per μm, or one every 1.80 μm (Fig. 6A to D). The PLB-labelled cell exhibited dominant frequencies for both PLB and LAMP-2 of 0.57 signal peaks per μm, or one every 1.74 μm (Fig. 6E to H). Data from a total of 18 cells dual-stained for LAMP-2 and RyR2 yielded an average (mean ± SEM) of 0.592 ± 0.015 and 0.590 ± 0.008 signal peaks per μm for each protein respectively, corresponding to a peak-to-peak distance of 1.69 μm. Data from a total of 4 cells dual-stained for LAMP-2 and PLB yielded an average of 0.594 ± 0.015 and 0.587 ± 0.010 signal peaks per μm respectively, corresponding to a peak-to-peak distance of 1.68 and 1.70 μm for LAMP-2 and PLB respectively in this data set. All of these values are within the expected range for a sarcomere of an isolated rabbit ventricular cardiomyocyte⁴⁰.

Despite this striking similarity between the signal frequencies of LAMP-2 and RyR2 or PLB, there was minimal spatial co-localisation between them. Pearson correlation coefficients for each pixel intensity for LAMP-2 vs RyR2 (representative cell Fig. 7A to C) and LAMP-2 vs PLB (representative cell Fig. 7D to F) were 0.42 ± 0.03 and 0.22 ± 0.06 respectively, indicating little overlap in the fluorescence. However, in both groups of cells there were areas where the signals from the two proteins came into very close proximity (for example Fig. 7C and F, white arrows). The mean distance between LAMP-2 and RyR2 or PLB was estimated by measuring the offset between the fluorescence intensity peaks of the two signals using the column intensity data described above. This gave a mean separation of 0.27 ± 0.03 μm between LAMP-2 and RyR2 (n = 16 cells) and 0.22 ± 0.05 μm between LAMP-2 and PLB (n = 3 cells). See Fig. 7G and H.

Microscopia Confocal: em Células Vivas Confirma Locais de Ligação de NAADP em Organelas Ácidas em Miócitos Ventriculares Cardíacos

O Ned-19 é um antagonista sintético específico do receptor de NAADP ²⁵ que também é derivado do triptofano e portanto fluorescente. De fato, o Ned-19 mostrou inibir a ligação do NAADP ao seu receptor, impedindo a liberação de cálcio em resposta ao NAADP ⁴¹ e pode ser usado para localizar a posição dos receptores do NAADP em células vivas ⁴² .

Live isolated rabbit ventricular cardiomyocytes were incubated with Ned-19 (100 μM, Fig. 8A) and LysoTracker red (500 nM, Fig. 8B), a commercially-available stain which is fluorescent when inside acidic compartments. There was a high degree of co-localisation between the signals (Fig. 8C and D, Pearson’s r = 0.69 ± 0.04, n = 8), confirming probable localisation of NAADP receptors on acidic organelles such as lysosomes, and the potential for NAADP-mediated calcium release from these organelles in live cells. Control experiments confirmed that LysoTracker signals did not bleed through into the Ned-19 channel and that cellular autofluorescence could not account for punctate signals under UV excitation (see Supplementary Figure 3). The incubation of cells with BZ-194, another (non-fluorescent) antagonist of NAADP prior to the addition of Ned-19 abolished the fluorescent signal, suggesting a specific binding site for these compounds, rather than accumulation as part of a degradative pathway (see Supplementary Figure 4).

Trabalhos anteriores apresentaram forte evidência funcional para o papel do NAADP como segundo mensageiro mobilizador de cálcio em miócitos cardíacos ^{2 , 3 , 20} . Os resultados descritos neste artigo fornecem evidências estruturais claras para nanojunções entre os lisossomos e tanto o SR quanto as mitocôndrias em miócitos ventriculares de coelho; observações da organização ultraestrutural que sustentam a plausibilidade de hipóteses funcionais anteriores ^{2 , 3 , 20 , 35 ,43} . Além disso, utilizamos a coloração de Ned-19 e LysoTracker em células vivas para localizar sítios de ligação a NAADP e mostramos que a ligação de NAADP é restrita a organelas ácidas em miócitos cardíacos.

Transmission electron microscopy (TEM) demonstrated that L-SR microdomains exist in the heart. Lysosomes in our TEM data have dimensions similar to those from previous publications³² and exhibit the expected range of electron densities³⁶. These methods have great utility in measuring membrane distances between organelles, however there are limitations to be considered in such techniques. We accept that some organelles included in our analysis may include late endosomes and potentially other lysosome-related organelles, however, re-assuringly immuno-gold labelling of the lysosome-specific protein LAMP-2 identified organelles in similar close proximity to the SR and mitochondria. Our findings of a median L-SR distance in the ventricle of 20 nm certainly falls within the expected range required for a functional microdomain identified by Fameli et al.’s modelling^32,44,45. As 2D images tend to overestimate minimum distances, further 3D tomography work was carried out to identify more accurate spatial interrelations between the organelles. Ten lysosomes were imaged in our 3D study, the median minimum distance to the nearest piece of SR was a mere 3.3 nm (for comparison – the distance between t-tubules and SR is ~20 nm).

A probable contribution of NAADP-mediated acidic store calcium signalling to whole-cell calcium transients in the heart has been established for nearly ten years, since the first paper published²⁰. This signalling is completely abolished in mice lacking TPC2 channels³ and appears to require both acidic stores and an intact SR^2,20, suggesting that calcium released from lysosomes affects SR calcium content and release. A role for lysosome-derived calcium released via TPC2 has also been implicated in other cell types, including the stimulation of calcium release from the ER in pancreatic beta cells¹³, granule exocytosis in T-cells⁴⁶ and protein trafficking in the endolysosomal degradation pathway of hepatocytes⁴⁷.

Nós mostramos a localização dos receptores de NAADP em lojas ácidas em miócitos ventriculares cardíacos usando um método de microscopia de células vivas. O Ned-19 é um antagonista funcional fluorescente do NAADP descoberto por meio da triagem virtual de moléculas com estruturas e densidades de carga semelhantes às do próprio NAADP ²⁵ . Demonstrou-se que impede a ligação do NAADP ao seu local de ligação endógeno e impede a liberação de cálcio em resposta à aplicação do NAADP ⁴¹ . Houve um alto grau de co-localização entre Ned-19 e LysoTracker na marcação vermelha em cardiomiócitos, sugerindo que o NAADP se liga a organelas ácidas nessas células. O padrão de coloração Ned-19, pontuado e distribuído por toda a célula, foi semelhante ao publicado em estudos com astrócitos em ratos ^42.. Algumas áreas adjacentes ao núcleo foram coradas com LysoTracker vermelho, mas não co-rotularam com Ned-19. É possível que eles representem o aparelho de Golgi ou que parte da gama de organelas acídicas ⁴⁸ não possa participar na sinalização de NAADP. A localização da ligação de NAADP às reservas ácidas está de acordo com nossos ^{2 , 3 , 20} e outros ^35 ,49 estudos anteriores no coração. Os controles de coloração mostram que as imagens do Ned-19 não surgiram do sangramento do sinal. O curso natural de captação e / ou degradação celular para alguns compostos é ele próprio através da via endo-lisossomal. De fato, acredita-se que o vírus Ebola utiliza esse processo para infectar células ¹⁰. Na presença de BZ194, um antagonista de NAADP baseado em ácido nicotínico, os sinais de Ned-19 não eram mais vistos em organelas ácidas. Isso sugere que o Ned-19 está se ligando a um local específico, ao contrário de se acumular dentro de organelas ácidas como parte da via de degradação. A identidade molecular do receptor de NAADP ainda permanece uma questão controversa, como reconhecido por Dammermann et al . ⁵⁰ . É interessante notar que o BZ194 foi proposto para antagonizar um aumento mediado pelo NAADP na abertura do RyR1 diretamente em RyRs em linfócitos T Jurkat ⁵⁰ . Um estudo anterior ⁵¹mostrou que a modificação de NAADP na porção de ácido nicotínico resulta em compostos que se ligam ao receptor NAADP de ouriço do mar com potência agonista alterada e podem antagonizar diretamente a ligação do próprio NAADP. Os estudos publicados ^{24 , 50 ,52 , 53 , 54} até agora não investigaram a ligação de BZ194 em outros sítios de ligação de NAADP propostos, no entanto, suas ações, tanto publicadas anteriormente quanto neste artigo, são consistentes com os efeitos nos receptores de NAADP, independentemente de seu sítio subcelular. .

As medições de TEM da distância entre um lisossoma e o T-túbulo mais próximo revelam uma média de 163 nm, o que está de acordo com a distância medida entre RyR2 e LAMP-2 usando imunofluorescência (268 nm). No entanto, isso é muito grande para sugerir um microdomínio de sinalização entre esses organelos nos miócitos ventriculares cardíacos, e isso não é totalmente inesperado, já que as conseqüências funcionais da liberação de cálcio relacionada ao lisossomo parecem estar restritas às RS; O fotorelease de NAADP não tem efeito sobre a corrente de cálcio do tipo L ^2 , 20 e o efeito da isoprenalina sobre as correntes de cálcio do tipo L não é diferente na ausência de sinalização mediada por NAADP ³. Tanto o RyR2 quanto o fosfolamban são proteínas encontradas na membrana do SR. Os RyR nos miócitos ventriculares cardíacos estão situados na membrana do SR, formando pares nos locais de contato do T-túbulo ⁵⁵ . A suposição de que a marcação do anticorpo LAMP-2 sempre resultará em uma função de difusão pontual centrada na membrana lisossomal mais próxima do T-túbulo ou SR não pode ser feita nessas experiências e uma distância média de LAMP-2 a RyR ou PLB medida por imunofluorescência deverá cair a uma distância entre as membranas mais próximas e mais distantes, levando em conta a coloração na membrana lisossomal que é imediatamente adjacente ao RS, bem como no lado mais distante.

Sujeitar os sinais de fluorescência de LAMP-2 à análise de Fourier das intensidades de fluorescência, somadas perpendicularmente ao comprimento da célula, revela uma periodicidade definida para o posicionamento de organelas ácidas em células cardíacas que é consistente com um padrão sarcomérico; a freqüência dominante da LAMP-2 de 0,59 sinais por μm se compara favoravelmente com o espaçamento sarcomérico esperado nestas células ⁴⁰ . A periodicidade da coloração de LAMP-2 observada durante os nossos experimentos é muito semelhante àquela observada para RyR2 e PLB, e em algumas células foi idêntica. A fim de investigar melhor essa relação, as defasagens de fase foram introduzidas artificialmente em um dos sinais e os coeficientes de correlação de Pearson foram recalculados. O efeito disso é mostrado na Figura 5., que ilustra que a correlação está no máximo quando o atraso introduzido é igual à distância média entre LAMP-2 e RyR2 ou PLB. Portanto, concluímos que os picos de sinal são bem definidos, mas separados por uma pequena quantidade, igual à distância média entre o LAMP-2 e as proteínas RyR2 ou PLB, e esse padrão repete todos os sarcômeros.

In many cell types, acidic store calcium signalling leads directly to calcium release from the endoplasmic reticulum³⁸. An all-or-nothing, ‘quantal’ calcium release pattern has been postulated to account for lysosomal calcium release in these cell types leading, if a threshold of quanta are released, to calcium-induced calcium release and calcium oscillations⁵⁶. Cells conforming to this ‘trigger’ hypothesis can have a trigger zone, in which acidic calcium stores are tightly packed in an appropriate signalling domain, for instance near RyR3 in pulmonary artery smooth muscle cells⁵⁷. Our immunolabelling data suggests that, in rabbit cardiac myocytes, lysosomes are also far from random in their positioning, exhibiting periodicity consistent with the length of a sarcomere. Our data do not suggest that all RyR or PLB are associated with lysosomes, but that a subset of the area of the SR forms a functional calcium signalling microdomain with lysosomes. Unlike in smooth muscle, this subset does not form a defined, single ‘trigger zone’ but is distributed throughout the cell.

Given the lysosome-SR distances measured by our TEM study, it is perhaps surprising that neither RyR nor PLB were seen to frequently co-localise with lysosomal membrane protein LAMP-2 in our immunocytochemistry study. Indeed, with the resolution limit of standard confocal microscopy, proteins on membranes that are a median distance of 3.3 nm apart would be expected to be indistinguishable. It is reasonable to assume that labelling of LAMP-2 will not always be seen on the membrane closest to the SR, as mentioned above, and it may be that the number of ‘co-localised’ areas is artificially lowered due either to clustering of signalling proteins at the SR nanojunction³⁰, i.e. presence of TPCs at the expense of LAMP-2, or difficulty in multiple antibodies with a size of ~10 nm⁵⁸ penetrating the junctional spaces which we have measured to be < 10 nm at their nearest point. It is not yet known whether all lysosomes contribute to NAADP signalling, however a lack of clear co-localisation in immunocytochemistry could indicate that only a subset of lysosomes is involved. In our TEM measurements, 48 of 69 lysosomes analysed were found in proximity with SR which could be defined as a membrane contact site, however cutting in a 2D plane cannot rule out that SR was in close apposition in other areas of the organelle. In 3D tomography measurements, all lysosomes imaged formed these MCS relationships with surrounding SR.

It was recently shown that NAADP acting via TPC1 channels may contribute to ischaemia-reperfusion injury in cardiac ventricular myocytes³⁵. Interactions between lysosomes and mitochondria have been observed in other tissues⁵⁹, and in cardiac atria⁶⁰. Analysis of our TEM images showed several instances where the distance between a lysosome and a mitochondrion was so small that a gap could not be resolved (which could be possible consequence of the section thickness (80 nm) and the angle of sectioning through the membrane). Autophagic processes may explain some of these interactions; it is well known that mitochondria are recycled by the endolysosomal system at the end of their useful life⁶¹. We did not include instances of lysosomes where membranes were deforming around, or were continuous with, those of adjacent mitochondria. While it is certainly possible that some of these close interactions represent lysosomes about to begin autophagy, the average measured distance of 17 nm in TEM data between mitochondrial membrane and lysosome membrane is highly supportive of microdomain signalling between these organelles. The nature of the images generated by 3D tomography suggests that even this small distance may be an over-estimate, as with L-SR separation, identifying a median distance of 6.2 nm between a lysosome and the closest mitochondrion.

Hearts from mice lacking TPC1, or exposed to NAADP receptor antagonists Ned-19 or Ned-K, have been shown to be partially protected from ischaemia-reperfusion injury. This was hypothesised to arise by prevention of calcium oscillations that cause opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP)³⁵. Opening of mPTP is known to be related to apoptotic and necrotic cell death⁶², such as during reperfusion after ischaemic injury in the heart⁶³. Nanojunctions found between ER and mitochondria are subjected to calcium concentrations much higher than those of the total cytosol during exposure to appropriate stimuli⁶⁴. Spatial proximity between the ER and mitochondria appears to underlie the rapid rise of mitochondrial calcium seen in response to IP₃R opening in rat liver cells, being abolished if tethering structures are artificially lengthened⁶⁵. It is also of note that when mitochondria-ER tethers were engineered to be < 5 nm, mitochondrial calcium uptake after ER IP₃R opening also led to mitochondrial calcium overload and mPTP opening⁶⁵. It seems plausible, therefore, that close association between lysosomes and mitochondria could be of functional significance with relation to the same pathway – an aspect that will have to be explored in future research.

Em resumo, este artigo representa a primeira descrição de nanojunções entre os estoques de cálcio ácido e o RS em cardiomiócitos de mamíferos. Isso está de acordo com trabalhos anteriores sobre o mesmo sistema de sinalização na musculatura lisa da artéria pulmonar ^32 , 33 e fibroblastos humanos ³⁴ . Juntamente com a confirmação de co-localização entre sítios de ligação de NAADP e lojas ácidas, isso fornece um contexto estrutural para hipóteses, gerado a partir de estudos farmacológicos em tecido ventricular cardíaco, que sugerem um papel para NAADP em aumentar CICR sobre estimulação β-adrenérgica ^20 , 43por aumentando a concentração de cálcio SR sem modular as correntes do canal de cálcio tipo L ^2 , 20.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia do Home Office do Reino Unido sobre a Lei de Operação de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986. Todos os protocolos experimentais (Anexo 1) foram aprovados pela Universidade de Oxford.

Isolamento de células ventriculares de coelho

Os cardiomiócitos foram isolados usando um método modificado de Powell, et al . ⁶⁶ .

Resumidamente, coelhos Male New Zealand White (aproximadamente 1 kg) foram sacrificados por overdose intravenosa de pentobarbitona sódica. O coração foi rapidamente excisado, lavado em solução contendo heparina (5 U / mL) e montado num aparelho de Langendorff para perfusão com solução de cálcio zero contendo (em mM) NaCl 136, KCl 5,4, NaHCO ₃ 12, piruvato de sódio 1 , NaH ₂ PO ₄ 1, MgCl ₂ 1, EGTA 0,04, glicose 5, gaseificada com 95% de O ₂ /5% de CO ₂ para manter o pH 7,4. Após 2 min, a digestão foi iniciada usando uma solução idêntica contendo 0,5 mg.ml- ^{1 de} colagenase tipo II (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ, EUA) e 100 μM de CaCl _2.em vez de EGTA. Isso foi permitido recircular por 30-35 minutos após o qual as células foram mecanicamente isoladas, filtradas, centrifugadas e suspensas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), ou fixadas em 60 min para microscopia eletrônica e imunocitoquímica.

Microscópio eletrônico

Amostras (de n = 3 animais) foram preparadas a partir de miócitos isolados fixados quimicamente ou de tecido ventricular intacto quimicamente fixado.

Rabbit ventricular cardiomyocytes isolated using the method described above, or approximately 1 mm³ pieces of tissue from ventricles were rapidly dissected (post Langendorff perfusion) and fixed in Karnovsky fixative (paraformaldehyde 4%, glutaraldehyde 5%, cacodylate buffer 80 mM, pH 7.4, Karnovsky)⁶⁷ and were embedded in Spurr’s resin⁶⁸. Sections were cut to approximately 80 nm thickness (Reichart Ultracut) and post-stained to achieve contrast by use of 2% aqueous uranyl acetate and Reynolds lead citrate. Images were obtained using a transmission electron microscope (TEM, Joel 1200EX II). Analysis and measurements were made using Gatan DigitalMicrograph and ImageJ software.

Lysosomes were identified by their previously well-documented appearance; that is, a matrix slightly more electron dense than the surrounding cytoplasm enclosed by a single lipid bilayer membrane³², see Fig. 1. Measurements from both cells and tissue were included in analysis and the subcellular appearance of these two preparations was indistinguishable under electron microscopy.

Electron tomography (ET)

Rabbit left ventricular tissue fragments (n = 6 animals), were fixed via Langendorff perfusion in iso-osmotic (300 mOsm) Karnovsky’s reagent (2.4% sodium cacodylate, 0.75% paraformaldehyde, 0.75% glutaraldehyde), were washed with 0.1 M sodium cacodylate, post-fixed in 1% OsO₄ for 1 h, dehydrated in graded acetone, and embedded in Epon-Araldite resin. Thick sections were cut (~275 nm, 3 sections per animal), transferred onto copper slot grids coated with 1% formvar and post-stained with 2% aqueous uranyl acetate, followed by Reynolds’ lead citrate. Colloidal gold particles (15 nm) were added to both surfaces of the sections to serve as fiducial markers for subsequent tilt series alignment. All sections were prepared and imaged at the Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells (University of Colorado, Boulder, CO), using an intermediate voltage electron microscope (Tecnai TF30; 4FEI-Company, Eindhoven, The Netherlands) operating at 300 kV, with images captured on a charge-coupled device camera (UltraScan; Gatan, Pleasanton, CA), at a pixel size of (1.206 nm²).

For dual-axis tomography, series of tilted views were collected from + 60° to −60° at 1° increments at 20,000x magnification. After the first tilt series was acquired, the specimen was rotated by 90° in the horizontal plane, and another + 60° to −60° tilt series was taken. Images from each tilt-series were aligned by fiducial marker tracking and back-projected to generate two single full-thickness reconstructed volumes (tomograms), which were then combined to generate a high-resolution 3D reconstruction of the original volume of interest. Tomograms were processed and analysed using the IMOD software, also used to segment and generate 3D models of the structures of interest^69,70. The models were smoothed and meshed to obtain a final 3D representation, in which spatial relationships of T-tubules, sarcoplasmic reticulum, mitochondria with lysosomes can be visualised.

Immunocytochemistry

Isolated rabbit ventricular cardiomyocytes were fixed within 60 minutes of isolation. Briefly, cells were allowed to settle for 20 minutes on flamed glass coverslips. The cells were fixed with 4% paraformaldehyde solution (Sigma, UK), before permeablisation with 0.2% Triton-X 100 (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) and blocked with 5% donkey serum. Cells were labelled with primary antibodies overnight at 4 °C (rabbit-anti-LAMP-2, Thermofisher PA1-655, Lot: PA189864, 1:100; mouse-anti-RyR2, Abcam ab2827, 1:100; mouse-anti-phospholamban, Abcam ab2865, 1:100). Secondary antibodies were diluted in 5% donkey serum (donkey-anti-rabbit-AlexaFluor-488, Thermofisher A-21206; donkey-anti-mouse-Dylight-555, Newmarket Scientific AS12-1935), and incubated at room temperature for 2 h (control cells where the primary or secondary was to be excluded were incubated with 5% donkey serum alone without addition of the relevant antibody). Coverslips were mounted using Vectashield Hardset with DAPI (Vectorlabs, Peterborough, UK) and sealed.

As lâminas foram armazenadas no escuro a 4 ° C e fotografadas em 48 h usando um microscópio confocal Olympus Fluoview FV1200. Imagens obtidas usando o microscópio confocal Olympus FV1200 com o software Fluoview não foram desconsideradas e a média de Kalman de quatro imagens foi usada para obter cada imagem final. Foi utilizada uma objetiva de aberração cromática com baixa imersão em óleo 60x e a abertura confocal foi ajustada para uma unidade Airy.

Análise de imagens obtidas por imunocitoquímica

As imagens confocais foram analisadas usando scripts personalizados do MatLab (Mathworks, Cambridge, Reino Unido) escritos internamente. Resumidamente, a orientação da célula foi automaticamente detectada e girada para alinhar verticalmente as estrias de RyR2 ou PLB antes do limiar para remover o ruído de fundo. A intensidade total para cada coluna vertical de pixels foi calculada e as formas de onda submetidas a uma transformada de Fourier usando o comando 'periodograma' do MatLab Signal Processing Toolbox para determinar as frequências dos componentes. Para analisar a distância entre a coloração adjacente, formas de onda de sinal foram sobrepostas e a distância entre os máximos de cada par de picos foi calculada. Os sinais de fluorescência DAPI foram submetidos ao mesmo processo que um controle; nenhum sinal sarcomérico foi detectado para esta mancha. O código MatLab foi publicado no Figshare sob o doi: 10.6084 / m9.figshare.3102769.

Microscopia confocal de células vivas

Miócitos ventriculares isolados de coelho foram incubados com 100 μM Ned-19 por 40 minutos em temperatura ambiente com adição de 500 nM de LysoTracker vermelho nos últimos 2 minutos. As c�ulas foram deixadas aderir a uma lamela de vidro e superfusadas com solu�o de Tyrode contendo (em mM): 135 NaCl, 4,5 KCl, 11 glucose, 20 HEPES, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2, pH 7,4 com NaOH. A fluorescência do Ned-19 foi excitada a 355 nm e detectada a 415 ± 30 nm (abordagem experimental semelhante à descrita em Barcelo-Torns et al . ⁴² ), enquanto LysoTracker vermelho foi excitada a 514 nm e coletada a 590-747 nm.

A imagem foi realizada com um microscópio confocal invertido Leica SP5 com uma objetiva de imersão em óleo 40x ou 63x. Para analisar a co-localização, as imagens foram suavizadas com um filtro Gaussiano (raio de 2 pixels) e intensidade de imagem mediana (36 × 36 pixels) subtraída da imagem suavizada para remover o ruído de fundo. Os coeficientes de correlação de Pearson foram calculados a partir das imagens resultantes usando o plugin ImageJ coloc2.

Estatisticas

Os dados são apresentados como média ± erro padrão para dados normalmente distribuídos e mediana (intervalo interquartil) para grupos distorcidos ou não paramétricos. Outliers foram identificados usando análise ROUT com Q = 1% (GraphPad Prism 6). O coeficiente de correlação produto-momento de Pearson (r) foi calculado para calcular o grau de correlação entre duas variáveis.

How to cite this article: Aston, D. et al. High resolution structural evidence suggests the Sarcoplasmic Reticulum forms microdomains with Acidic Stores (lysosomes) in the heart. Sci. Rep. 7, 40620; doi: 10.1038/srep40620 (2017).

Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

A RAB e a GRM reconhecem com gratidão o apoio à pesquisa das respectivas Bolsas Sir Henry Dale, financiadas conjuntamente pelo Wellcome Trust e pela Royal Society (Grant Numbers 109371 / Z / 15 / Z e 101222 / Z / 13 / Z). O RAC é financiado pelo Wellcome Trust (109371 / Z / 15 / Z). DA reconhece o apoio do Centro de Excelência em Pesquisa da Fundação Britânica do Coração (BHF CRE), Oxford (concessão do código RE / 08/004). KLF reconhece o apoio da Sociedade Fisiológica. A AG é financiada por um Subsídio para o Programa Wellcome Trust e um Investigador Sênior. A EARZ e a PK possuem bolsas da British Heart Foundation. PK reconhece o apoio do ERC Advanced Grant CardioNect. Os autores gostariam de agradecer ao Prof Fran Platt e Profa. Franzini-Armstrong pela assessoria técnica em imagens de microscopia eletrônica (ME) dos lisossomos; A Sra. Lynne Scott pelo suporte técnico e o Dr. Errin Johnson e a Escola de Microscopia Eletrônica de Patologia da Universidade de Oxford; Prof Dainius Pauzer, Universidade Lituana de Ciências da Saúde, por fornecer feedback e sugestões sobre experimentos EM e o rascunho em papel. Também agradecemos aos professores Richard Vaughan-Jones e Pawel Swietach pelo acesso a microscópios confocais e sugestões úteis, e aos Drs Anthony Morgan e Lianne Davis por conselhos experimentais. A tomografia foi realizada no Laboratório de Boulder para Microscopia Eletrônica 3D de Células, Universidade do Colorado, Boulder, Colorado (apoiada por P41GM103431 do National Institute of Health). para fornecer feedback e sugestões sobre experimentos EM e o rascunho do papel. Também agradecemos aos professores Richard Vaughan-Jones e Pawel Swietach pelo acesso a microscópios confocais e sugestões úteis, e aos Drs Anthony Morgan e Lianne Davis por conselhos experimentais. A tomografia foi realizada no Laboratório de Boulder para Microscopia Eletrônica 3D de Células, Universidade do Colorado, Boulder, Colorado (apoiada por P41GM103431 do National Institute of Health). para fornecer feedback e sugestões sobre experimentos EM e o rascunho do papel. Também agradecemos aos professores Richard Vaughan-Jones e Pawel Swietach pelo acesso a microscópios confocais e sugestões úteis, e aos Drs Anthony Morgan e Lianne Davis por conselhos experimentais. A tomografia foi realizada no Laboratório de Boulder para Microscopia Eletrônica 3D de Células, Universidade do Colorado, Boulder, Colorado (apoiada por P41GM103431 do National Institute of Health).

Notas do autor

1. • Daniel Aston
   •  & Rebecca A. Capel

   Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.

   • Rebecca AB Burton
   •  & Derek A. Terrar

2. Esses autores supervisionaram conjuntamente esse trabalho.

Afiliações

1. Departamento de Farmacologia da Universidade de Oxford, Mansfield Road, Oxford, OX1 3QT, Reino Unido; BHF Center of Research Excellence, Universidade de Oxford, Reino Unido

   • Daniel Aston
   • , Rebecca A. Capel
   • , Antony Galione
   • , Rebecca AB Burton
   •  & Derek A. Terrar

2. Departamento de Fisiologia, Anatomia e Genética, Sherrington Building, Universidade de Oxford, Sherrington Road, Oxford, OX1 3PT, Reino Unido; BHF Center of Research Excellence, Universidade de Oxford, Reino Unido

   • Kerrie L. Ford
   •  & Helen C. Christian

3. Biologia Computacional, Departamento de Ciência da Computação, Wolfson Building, Universidade de Oxford, Oxford, OX1 3QD, Reino Unido

   • Gary R. Mirams

4. Instituto Nacional do Coração e Pulmão, Imperial College London, Londres, Reino Unido

   • Eva A. Rog-Zielinska
   •  & Peter Kohl

5. Instituto de Medicina Cardiovascular Experimental do Centro Cardíaco Universitário Freiburg / Bad Krozingen, Faculdade de Medicina da Universidade de Freiburg, Alemanha

   • Peter Kohl

Contribuições

DA e RAC realizaram isolamentos de células, escreveram o manuscrito e elaboraram figuras com revisão de todos os autores. DA e RAC realizaram coloração celular e imagem imunofluorescente DA. KLF e RABB realizaram estudos de co-localização de Ned-19 e LysoTracker. HC contribuiu para a interpretação dos dados EM. HC e RABB realizaram a preparação da amostra de TEM e imagem. EARZ realizou a preparação de tomografia 3D e imagem, EARZ e PK realizada análise e interpretação de tomografia 3D. DA analisou o trabalho do TEM, EARZ analisou a tomografia 3D. GM escreveu os scripts do MatLab. GM e DA realizaram análises MatLab e testes estatísticos. RABB, DAT e AG projetaram o estudo.

Interesses competitivos

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

autor correspondente

Correspondência para Rebecca AB Burton .

História de publicação

DOI

https://doi.org/10.1038/srep40620