Microchips de eletroforese

Separação e determinação de ânions em amostra aquosa por eletroforese em microssistema com detecção C4D (ME-C4D)

Sodré Gonçalves de Brito Neto

Núcleo Livre , Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia/GO, Brasil

PROFESSOR LUCAS MATTOS DUARTE

Introdução

A eletroforese , que é a técnica de segregação de partículas , de solutos em meio líquido, quando sob forte campo elétrico,  permite uma série de variações e conjugações que geram diversas possibilidades de segregação e identificação de diversos compostos com custos baixos em relação a muitos outros equipamentos . No atual trabalho identificamos 3 analitos por eletroforese reversa; cloreto, nitrato e acetato.

Materiais e métodos

Equipamento:

Foi usado equipamento ER490 é um sistema para experimentos de eletroforese de microchips. Inclui detecção de condutividade sem contato (C4D). Diferentemente do ER455 , o sistema ER490 possui os eletrodos C4D na plataforma ET121 em vez de no chip, tornando o sistema mais versátil. O sistema inclui dois chips microfluídicos Zeonor ( ET195-2 ); chips com um design semelhante desenvolvido pelo usuário podem ser usados ​​com este sistema. O sistema inclui o software PowerChrom para coleta e análise de dados e o software QuadSequencer para controlar a unidade HVS para experimentos com injeções flutuantes, fechadas ou comprimidas, que foi o que usamos nesta experiência.

O ER490 inclui:

• Detector ER815 C4D com software PowerChrom
• Sequenciador de alta tensão ER430
• Cabos de alta tensão EC230
• Plataforma de microchip ET121 com eletrodos C4D, com dois chips de Zeonor ET195-2
• Soluções de teste padrão EC020
• Braçadeira de fio de chumbo ET067

Microchip

Vários sistemas e variações podem ser adaptadas aos testes por eletroforese https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-8964-5_13 . No uso de microchips a pesquisa aponta pelo menos 4 delas (simplest, floating, pinched e gated) : 

O chip de eletroforese capilar de dolomita Mitos A que  separa as espécies em sua proporção de tamanho e carga^{«Nanotechnology Now - Press Release: Dolomite Microfluidic Glass Chip Separates Biological Molecules. www.nanotech-now.com} 

^{«Nanotechnology Now - Press Release: Dolomite Microfluidic Glass Chip Separates Biological Molecules.} 

100 mm/L de MES "é o nome comum para o composto ácido 2- ( N- morfolino) etanossulfônico . Sua estrutura química contém um anel de morfolina . Tem um peso molecular de 195,2 e a fórmula química é C ₆ H ₁₃ NO ₄ S. Os sinônimos incluem: ácido 2-morfolinoetanossulfônico; Ácido 2- (4-morfolino) etanossulfónico; Ácido 2- (N-morfolino) etanossulfónico; Ácido 2- (4-morfolino) etanossulfónico; MES; Hidrato de MES; e hidrato de ácido morfolin-4-etanossulfónico. O MOPS é um composto tampão de pH semelhante que contém uma porção propanossulfônica em vez de uma porção etanossulfônica".^[2]

100 mm/L de Histidina "(abreviadamente, His ou H) é um aminoácido essencial. As proteínas são constituídas a partir de 20 aminoácidos padrão, chamados de α-aminoácidos, já que, com exceção da prolina, apresentam um grupo amino primário e um grupo carboxila ligado ao mesmo átomo de carbono".^[3]

Amostras

Cloreto, nitrato e acetato.

Estoque CTAB 2 mm/L - "O brometo de cetrimônio ([(C ₁₆ H ₃₃ ) N (CH ₃ ) ₃ ] Br; brometo de cetiltrimetilamônio; brometo de hexadeciltrimetilamônio; CTAB ) é um surfactante quaternário de amônio .

É um dos componentes da cetrimida anti-séptica tópica . O cátion cetrimonium (hexadeciltrimethylammonium) é um agente anti-séptico eficaz contra bactérias e fungos. É também um dos principais componentes de alguns tampões para a extração de DNA. Tem sido amplamente utilizado na síntese de nanopartículas de ouro ( por exemplo , esferas, bastões, bipiramides), nanopartículas mesoporosas de sílica ( por exemplo,, MCM-41) e produtos de condicionamento de cabelo. Os compostos intimamente relacionados, cloreto de cetrimônio e estearato de cetrimônio, também são usados como anti-sépticos tópicos e podem ser encontrados em muitos produtos domésticos, como xampus e cosméticos. O CTAB, devido ao seu custo relativamente alto, normalmente é usado apenas em cosméticos selecionados.

Como a maioria dos surfactantes, o CTAB forma micelas em soluções aquosas. A 303 K (30 ° C), forma micelas com número de agregação 75-120 (dependendo do método de determinação; média ~ 95) e grau de ionização, α = 0,2–0,1 (carga fracionária; de baixa a alta concentração). A constante de ligação (K °) do contra- Br ^- a uma micela CTA ⁺ a 303 K (30 ° C) é de ca. 400 M-1. Este valor é calculado a partir de medições de eletrodo seletivo de íons Br ^- e CTA ⁺ e dados de condutometria , usando dados da literatura para o tamanho de micelas (r = ~ 3 nm) ^{[ citação necessário ]}, extrapolado para a concentração crítica de micelas de 1 mM . No entanto, o K ° varia com a concentração total de surfactante, sendo extrapolado até o ponto em que a concentração de micelas é zero".^{Cetrimonium bromide}

Tampão de 30 mm/L de MES, 15 mm/L de Histidina e 0,05 mm/L de CTAB

Injeção de 1 minuto com floating de 1 segundo. 

Cálculo da mobilidade

A fórmula básica é L.l/t.v onde L= Distância da injeção até a saída. l= local de detecção . t= tempo. v= voltagem, porém não foi possível calcular devido não ter sido dado tempo de fluxo. Portanto apenas uma mobilidade aparente.


Cálculo de Eficiência 

N= 16 (tmi/wi)²

Cáculo de resolução

2(tmb - tma)/wa - wb

Bolha, ruído  e o CTBA

Percebemos que o CTBA permite boa mobilidade de fluxo, mas espuma e gera bolhas, o que gera "ruídos" e muitos picos  no gráfico,  pelo menos no início das injeções, mas tendem a diminuir e gerar estabilidade de fluxo. 

Quintuplicata

Em 5 injeções , recomenda-se o referencial médio entre a 2a e a 4a passagem ,  levando em conta apenas a 2a, 3a e 4a passagem, ignorando a primeira e a última. A  diferença entre a primeira e a segunda costuma ser muito grande devido a vários fatores, entre eles, talvez o principal, seja o efeito da tensão no ambiente geral e analitos; o que depois da segunda passagem , tende a estabilizar os valores gerando maiores repetições e aproximações . 

Resultados

Sem inverter o fluxo não teríamos resultados relacionados ao acetado devido seu tamanho. Inverteu-se o fluxo mudando os polos negativos com positivos. 

Dos sistemas aplicados ao chip foi usado o "flotation" onde se cria na interseção um fluxo que desvia e afunila o fluxo do analito. Desliga 1 segundo o que faz criar uma banda ao centro e depois liga novamente, separando assim parte menor da amostra para que seja detectado  com picos mais "finos" referentes ao analitos. 

Na trilha maior foi estabelecido potencial de 1800 volts e na menor 1200 volts. 

Foi preciso zerar no software  QuadSequencer formador do gráfico de detecção para que a linha ficasse reta

Preenchemos as trilhas fininhas do capilar com aparelho manual .

Ligou, estabilizou a linha, zerou sinal no software e depois desligou por 1 segundo  a trilha maior de 1800 volts,  para gerar a "bolsa" na amostra injetada na trilha menor de 1200 volts, fazendo-a desprender até chegar ao detector . A relação 12200 volts para trilha de menor percurso para 1800 volts de maior percurso foi previamente otimizada por meio de experiências e cáculos aproximados.

Houveram 3 tentativas até que os picos dos  analitos apareceram, não tão finos. Houve queda de estrato da linha logo após os picos. E houve uma repetição de imagem a partir principalmente da segunda injeção  o que confirmou o sistema de detecção pela repetibilidade.    

Conclusões

O sistema funcionou para detecção da presença dos analitos descritos o que permite tipos de testes em outros produtos alegando conter os mesmos. 

Separação e Determinação de Ânions em Amostra Aquosa por Eletroforese em Microssistema com Detecção C4D (ME-C 4D)

Sodré Gonçalves de Brito Neto

Núcleo Livre , Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia/GO, Brasil

PROFESSOR LUCAS MATTOS DUARTE

Resumo: Fizemos uma experiência laboratorial de eletroforese invertida usando microchip de vidro para detecção de cloreto de sódio, nitrato de sódio e acetato de sódio no laboratório de eletroforese da UFG. Depois de 3 tentativas conseguimos verificar os picos se repetintindo em 5 passagens, das quais ignoramos a primeira e a última para distinguir uma média dos valores obtidos. A inversão dos polos e a inserção de CTAB que modificou a polaridade da parede do capilar , tornando-a positiva, o que foi necessária para detectar o acetato devido sua mobilidade no sistema normal não permitir detecção.

Introdução

A eletroforese é a técnica de segregação de partículas , de solutos em meio líquido, quando sob forte campo elétrico, que permite uma série de variações e conjugações que geram diversas possibilidades de segregação e identificação de diversos compostos. Comparando a técnica a outros métodos, esta apresenta muitas vantagens como custos baixos, adaptabilidade e flexibilidade, menor gasto de amostra entre outros . A tecnologia de eletroforese se aprofundou e vem se tornando cada vez mais eficiente, onde destacamos os microchips com seus microcanais construídos em quartzo, vidro ou plástico (dimetilsiloxano) (PDMS), policarbonato (PC), poli (metilmetacrilato) (PMMA), polyester-tonner, os quais permitem análise de diversas amostras, misturas, reação química, pré-tratamento, separação de forma cada vez mais eficiente e rápida. No atual trabalho identificamos 3 analitos por eletroforese reversa; cloreto, nitrato e acetato.

Materiais e métodos

Foi usado equipamento ER490 é um sistema para experimentos de eletroforese de microchips. Inclui detecção de condutividade sem contato (C4D). Diferentemente do ER455 , o sistema ER490 possui os eletrodos C4D na plataforma ET121 em vez de no chip, tornando o sistema mais versátil. O sistema inclui dois chips microfluídicos Zeonor ( ET195-2 ); chips com um design semelhante desenvolvido pelo usuário podem ser usados ​​com este sistema. O sistema inclui o software PowerChrom para coleta e análise de dados e o software QuadSequencer para controlar a unidade HVS para experimentos com injeções flutuantes, fechadas ou comprimidas, que foi o que usamos nesta experiência.

O ER490 inclui:

Detector ER815 C4D com software PowerChrom

Sequenciador de alta tensão ER430

Cabos de alta tensão EC230

Plataforma de microchip ET121 com eletrodos C4D, com dois chips de Zeonor ET195-2

Soluções de teste padrão EC020

Braçadeira de fio de chumbo ET067

Miniaturização e eletroforese em microchips

Os sistemas menores demonstram permitir maior definição nos picos e apresentam uma série de vantagens, incluindo a rapidez.

Vários sistemas e variações podem ser adaptadas aos testes por eletroforese [1]. No uso de microchips a pesquisa aponta pelo menos 4 delas (simplest, floating, pinched e gated).

Dos sistemas aplicados ao chip foi usado o "gated" onde se cria na interseção um fluxo que desvia e afunila o fluxo do analito. Desliga a fonte do fluxo (no caso de 1800v) por 1 segundo, o que faz criar um excesso na interceção, e a banda criada ao centropara que quando ligar o fluxo novamente, se desloque parte da amostra para o fluxo, separando assim parte menor da amostra para que seja detectado  com picos mais "finos" referentes ao analitos. O chip de eletroforese capilar Mitos separa as espécies em sua proporção de tamanho e carga[2] tração crítica de micelas de 1 mM . No entanto, o K ° varia com a concentração total de surfactante, sendo extrapolado até o ponto em que a concentração de micelas é zero".

Fluxo Eletroosmótico (EOF) ou Eletroforese Capilar (CE)

Tampão de 30 mm/L de MES, 15 mm/L de Histidina e 0,05 mm/L de CTAB, Injeção de 1 minuto, que teve como resultados a mudança do capilar de negativo para positivo, o que associado a mudança dos polos fez inverter o fluxo, pois sem inverter o fluxo não teríamos resultados relacionados ao acetado devido seu tamanho e mobilidade.

100 mm/L de MES "é o nome comum para o composto ácido 2- ( N- morfolino) etanossulfônico . Sua estrutura química contém um anel de morfolina . Tem um peso molecular de 195,2 e a fórmula química é C 6 H 13 NO 4 S. Os sinônimos incluem: ácido 2-morfolinoetanossulfônico; Ácido 2- (4-morfolino) etanossulfónico; Ácido 2- (N-morfolino) etanossulfónico; Ácido 2- (4-morfolino) etanossulfónico; MES; Hidrato de MES; e hidrato de ácido morfolin-4-etanossulfónico. O MOPS é um composto tampão de pH semelhante que contém uma porção propanossulfônica em vez de uma porção etanossulfônica".[3] 100 mm/L de Histidina "(abreviadamente, His ou H) é um aminoácido essencial. As proteínas são constituídas a partir de 20 aminoácidos padrão, chamados de α-aminoácidos, já que, com exceção da prolina, apresentam um grupo amino primário e um grupo carboxila ligado ao mesmo átomo de carbono".[4] cloreto, nitrato e acetato. Estoque CTAB 2 mm/L - "O brometo de cetrimônio ([(C 16 H 33 ) N (CH 3 ) 3 ] Br; brometo de cetiltrimetilamônio; brometo de hexadeciltrimetilamônio; CTAB ) é um surfactante quaternário de amônio . É um dos componentes da cetrimida anti-séptica tópica . O cátion cetrimonium (hexadeciltrimethylammonium) é um agente anti-séptico eficaz contra bactérias e fungos. É também um dos principais componentes de alguns tampões para a extração de DNA. Tem sido amplamente utilizado na síntese de nanopartículas de ouro ( por exemplo , esferas, bastões, bipiramides), nanopartículas mesoporosas de sílica ( por exemplo,, MCM-41) e produtos de condicionamento de cabelo. Os compostos intimamente relacionados, cloreto de cetrimônio e estearato de cetrimônio, também são usados como anti-sépticos tópicos e podem ser encontrados em muitos produtos domésticos, como xampus e cosméticos. O CTAB, devido ao seu custo relativamente alto, normalmente é usado apenas em cosméticos selecionados. Como a maioria dos surfactantes, o CTAB forma micelas em soluções aquosas. A 303 K (30 ° C), forma micelas com número de agregação 75-120 (dependendo do método de determinação; média ~ 95) e grau de ionização, α = 0,2–0,1 (carga fracionária; de baixa a alta concentração). A constante de ligação (K °) do contra- Br - a uma micela CTA + a 303 K (30 ° C) é de ca. 400 M-1. Este valor é calculado a partir de medições de eletrodo seletivo de íons Br - e CTA + e dados de condutometria , usando dados da literatura para o tamanho de micelas (r = ~ 3 nm) extrapolado para a concentração .

3) Análise de ânions;

Este trabalho teve como objetivo, a determinação e a separação de ânions em meio aquoso por meio de eletroforese em microchips, com detecção C4D (ME-C4D). A separação de ânions por eletroforese capilar foi conduzia em soluções aquosas de eletrólitos contendo MÊS (ácido-2-(N-morfolino)entanosulfonico monohidratado ) e Histidina (30/15 mmol.L^-1), foi adicionado também uma solução 0,05 mmol.L^-1 de CTAB (Brometo de Cetrimônio) que modifica a superfície capilar, assim invertendo o fluxo eletroosmótico e diminuindo o tempo de análise. As amostras estoque, foram soluções aquosas de Cloreto de sódio, Nitrato de sódio e Acetato de sódio, todos com concentração de 10mmol.L^-1.

Conclusões

A inversão de fluxo permitiu detectar o acetato que com fluxo normal (+-) não foi possível.

Materiais e métodos

As amostras estoque foram diluídas para que ficassem com a concentração de 100 umol.L^-1, para que fosse feito as análises no microchip.

Sistema comercial de eletroforese em microssistema (marca eDAQ), constituído de uma plataforma microfluídica, uma fonte de alta tensão, um detector C4D e um sistema de aquisição de dados. O microchip utilizado foi de vidro, configuração em duplo T com gap de 100 µm com comprimento total de 85mm e comprimento efetivo de 78mm, os canais possuem de largura e altura 100 e 10 µm . Foi utilizada a injeção no modo Gated - 1 s / -1400 V (reservatório de amostra) / -2000 V (reservatório BGE), com detecção C4D (frequência 1200 kHz / 100%).

Foram feitas 3 analises da mesma amostra, para que pudesse obter as médias, e o desvio padrão para a confecção da curva de calibração utilizando o software excel, assim sendo possível determinar sua concentração e a margem de erro das mesmas.

Resultado e discussão

Depois de estabelecermos o fluxo invertido mundando os polos e acrescentando 0,05 mmol.L^-1 de CTAB que mudou a polaridade da parede do capilar , invertendo os polos do fluxo (1800 v), o acetato da amostra, foi detectado .

Os cálculos das mobilidades foram feitos utilizando as seguintes expressões:

µap= mobilidade aparente= é dada pelo produto dos comprimentos efetivo mais total dividido pelo tempo de migração do análito pelo potencial aplicado.

µeo= mobilidade eletrosmotica= é dada pelo produto dos comprimentos efetivo mais total dividido pelo tempo de migração do EOF pelo potencial aplicado.

µap= µeo + µep mobilidade eletroforética.

Mobilidades aparente de cada analito foi: Cloreto= 7,68x10^-3 cm².v^-1.s^-1 ; Nitrato= 7,56x10^-3 cm².v^-1.s^-1; Acetato= 6,99x10^-3 cm².v^-1.s^-1. As mobilidades eletroforéticas de cada analito foi: 1,23x10^-3 cm².v^-1.s^-1 ; Nitrato= 1,35x10^-3 cm².v^-1.s^-1; Acetato= 1,92x10^-3 cm².v^-1.s^-1 Mobilidade eletroosmótica é: 8,91x10^-3 cm².v^-1.s^-1.

Os cálculos de eficiência foram feitos utilizando as seguintes expressões:

N= Eficiência= é dada pelo tempo de migração dividido pela largura do pico ao quadrado.

As eficiências de cada analito foi: Cloreto = 235.548,44 pratos teóricos; Nitrato = 176.880,32 pratos teóricos; Acetato = 101.633,14 pratos teóricos.

Determinação dos ânions: após todas as analises, foi feita a curva de calibração para a determinação da concentração de cada ânion. Figura 1: ânion cloreto, a equação da reta linear é dada pela equação y = 0,0361x - 0,1327, onde a partir desta equação foi determinado a concentração do ânion analisado igual a 84 µmol.L^{-1 +}_{_} 0,2513 µmol.L^-1. Figura 2: ânion nitrato, a reta linear é dada pela equação y = 0,0389x - 0,1733, onde a partir desta equação foi determinado a concentração do ânion analisado igual a 96,4 µmol.L^-+_{_} 0,2905¹ µmol.L^-1. Figura 3: ânion acetato, a reta linear é dada pela equação y = 0,0213x + 0,0367, onde a partir desta equação foi determinado a concentração de ânion analisado igual a 78,38 µmol.L^{-1 +}_{_} 6,8x10 ^-6 µmol.L^-1. Tabela 1: dados referentes a área dos picos e tempo de migração de cada analito.

Tabela 1: Pico 1: ânion cloreto; Pico 2: ânion nitrato; Pico 3; ânion acetato.

Concentração µmol.L-1

Concentração µmol.L-1

Figura 1: curva de calibração do ânion cloreto Figura 2: curva de calibração do ânion nitrato

Figura 3: curva de calibração do ânion acetato.

Referências

1. Tavares, Marina Franco Maggi; Carrilho, Emanuel; Coltro, Wendell Karlos Tomazelli; Silva, José Alberto Fracassi da (2007). «Terminologia para as técnicas analíticas de eletromigração em capilares». Química Nova. 30 (3): 740–744. ISSN 0100-4042. doi:10.1590/S0100-40422007000300040

«DeCS Server - List Exact Term». decs.bvs.br. Consultado em 12 de setembro de 2019

2. «Eletrosmose». Wikipédia, a enciclopédia livre. 26 de maio de 2009

3. Gomez, Federico J. V.; Silva, María Fernanda (2019). Dutta, Debashis, ed. «Microchip Electrophoresis Tools for the Analysis of Small Molecules». New York, NY: Springer New York. Methods in Molecular Biology (em inglês): 197–206. ISBN 9781493989645. doi:10.1007/978-1-4939-8964-5_13

4. Fu, Lung-Ming; Tsai, Chien-Hsiung (2008). Li, Dongqing, ed. «Electrokinetic Sample Injection». Boston, MA: Springer US (em inglês): 529–536. ISBN 9780387489988. doi:10.1007/978-0-387-48998-8_429

5. «Nanotechnology Now - Press Release: Dolomite Microfluidic Glass Chip Separates Biological Molecules». www.nanotech-now.com (em inglês). Consultado em 31 de outubro de 2019

6. «MES (buffer)». Wikipedia (em inglês). 12 de julho de 2019

7. «Histidina». Wikipédia, a enciclopédia livre. 7 de abril de 2019

Apêndice

Mobilidade aparente

µap cloreto = = 7,68x10^-3 cm².v^-1.s^-1

µap nitrato = = 7,56x10^-3 cm².v^-1.s^-1

µap acetato= = 6,99x10^-3 cm².v^-1.s^-1

Mobilidade eletroosmotica

µap EOF= = 8,91x10^-3 cm².v^-1.s^-1

Mobilidade eletroforetica

µap= µeo + µep

µep= - µap + µeo

µep cloreto = - 7,68x10^-3 + 8,91x10^-3 = 1,23x10^-3 cm².v^-1.s^-1

µep nitrato=- 7,56x10^-3 + 8,91x10^-3 = 1,35x10^-3 cm².v^-1.s^-1

µep acetate= - 6,99x10^-3 + 8,91x10^-3 = 1,92x10^-3 cm².v^-1.s^-1

Eficiência

N _cloreto = = 235.548,44 pratos teóricos;

N _nitrato = = 176.880,32 pratos teóricos;

N _acetato = = 101.633,14 pratos teóricos.

Determinação das concentrações de cada ânion analisado

Ânion cloreto: y = 0,0361x - 0,1327 onde y= área do pico; x= concentração a ser encontrada.

X= 2,9+ 0,1327/0,0361 x= 84,00 µmol.L^-1

Ânion nitrato: y = 0,0389x - 0,1733 onde y= área do pico; x= concentração a ser encontrada.

X= 3,58 + 0,1733/0,0389 x= 96,40 µmol.L^-1

Ânion nitrato: y = 0,0213x + 0,0367 onde y= área do pico; x= concentração a ser encontrada.

X= 16333+ 0,0367/0,0213 x= 78,38 µmol.L^-1

Desvio padrão relativo = S/ média x 100

Desvio P. R. cloreto= (0,729/2,9)x100 = 0,2513 µmol.L^-1

Desvio P. R. nitrato = (1,042/3,5866)x100 = 0,2905 µmol.L^-1

Desvio P. R. acetato = (0,1123/1,6333)x100 = 6,8x10 ^-4 µmol.L^-1

Referências (ABNT)