2.1 Reagentes e materiais

Todos os reagentes eram de grau analítico. Solução de cloroformato de (+) - 1‐ (9 ‐ fluorenil) etil (FLEC ‐ Cl), ácido d ‐ glutâmico, d ‐ histidina, d ‐ treonina, l - alanina, l ‐ arginina, l - asparagina, ácido l - aspártico, l- cisteína, ácido l- glutâmico, l- glutamina, l- histidina, l- isoleucina, l- leucina, l- lisina, l- metionina, l- prolina, l- serina, l- treonina, l- triptofano,l- tirosina e l- valina, dl- alanina, dl- arginina, dl- asparagina, dl- ácido aspártico, dl- cisteína, dl- ácido glutâmico, dl- histidina, dl- isoleucina, dl- leucina, dl- lisina, dL- fenilalanina, dl- prolina, DL- serina, dl- triptofano, dl- valina, ácido bórico, glicerol, glicina, hidróxido de sódio, tetraborato de sódio, e N-acetil- dl -triptofano foram da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha ) Isopropanol,dl ‐ metionina, dl ‐ tirosina, SDS e acetonitrila foram fornecidos pela Fluka (Steinheim, Alemanha). A água foi desionizada e purificada com um sistema de purificação Milli-Q (Millipore, Belford, NJ, EUA). O passe de banda de 260 nm, o passe curto de corte de 300 nm e o passe curto de corte de 325 nm foram da Asahi Spectra (Torrance, CA, EUA). O filtro de excitação de passagem de banda de 240 a 400 nm era da Flux Instruments (Basel, Suíça). Os filtros de banda de emissão de 305 e 320 nm e o filtro de passagem longa de 335 nm foram de Melles Griot (Didam, Países Baixos).

O BGE final foi tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) contendo SDS 25 mM e isopropanol a 15% v / v. O pH foi ajustado com hidróxido de sódio 1 M. O BGE foi filtrado antes do uso através de filtros de nylon descartáveis ​​de 0,45 μm da VWR (Amsterdã, Holanda). As soluções de reserva (2 mM) de AA foram preparadas em tetraborato de sódio 5 mM (pH 9,2).

2.2 Instrumentação e métodos

As experiências de CE foram realizadas com um instrumento P / ACE MDQ CE (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). O CE dos AA foi realizado com capilares de sílica fundida (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, EUA). Os capilares tinham um id de 75 μm, um od de 375 μm e comprimentos totais / efetivos de 43,9 / 33,2 cm para as medições CE-UV e 73,2 / 55,3 cm para as medições CE-Flu, respectivamente. A temperatura capilar foi ajustada para 25 ° C.

Os novos capilares de sílica fundida foram lavados com hidróxido de sódio 1 M por 15 min a 30 psi e água desionizada por 15 min a 30 psi. No início de cada dia útil, os capilares foram lavados com hidróxido de sódio 1 M subsequente por 15 min a 30 psi, água por 15 min a 30 psi e BGE por 30 min a 30 psi. Entre as análises de CE, os capilares foram lavados com BGE por 10 min a 30 psi. Durante a noite, os capilares foram armazenados em água deionizada.

As separações foram realizadas no modo de polaridade normal, com uma tensão de separação de 18 kV para medições CE – UV e 30 kV para medições CE – Flu, usando um tempo de rampa de 2 min. A injeção da amostra foi realizada hidrodinamicamente, aplicando-se 0,6 psi por 4 se 10 s para medições CE-UV e CE-Flu, respectivamente, o que corresponde a um volume de amostra de cerca de 1,1 e 0,95%, respectivamente, do volume capilar total (viscosidade da BGE relativamente à água é 1.6). A aquisição dos dados foi realizada utilizando o software 32 Karat (Beckman Coulter).

O sistema de detecção de fluorescência Argos 250B (Flux Instruments, Basel, Suíça) compreende uma lâmpada Xe ‐ Hg para guias e filtros de luz de excitação, excitação e emissão, uma célula de detecção de cone óptico e um tubo fotomultiplicador (PMT). Seu design e desempenho para detecção de fluorescência de proteínas foram descritos em mais detalhes anteriormente 52 . Um detector de fluorescência resolvido por comprimento de onda (wrFlu) para CE foi construído modificando o Argos 250B 53. O detector PMT foi substituído por um espectrógrafo SR ‐ 163 equipado com uma câmera CCD DV420A, ambas da Andor Technologies (Darmstadt, Alemanha). A fibra de emissão da célula de detecção foi acoplada ao espectrógrafo com um suporte de fibra caseiro. O espectrógrafo tinha uma grade de 600 linhas / mm ardida a 300 nm, uma passagem de banda de 263 nm, uma fenda de entrada de luz com largura ajustável e um chip CCD retroiluminado de 256 × 1024 pixels com um tamanho de pixel de 26 μm ²para detecção da luz de emissão dispersa. O chip CCD foi resfriado a -60 ° C. O espectrógrafo foi calibrado diariamente, usando as linhas espectrais de referência da fonte de luz de raios-X Hg (LOT-Oriel, Darmstadt, Alemanha). As configurações típicas de detecção usadas nos experimentos CE-wrFlu foram: largura da fenda, 500 μm; tempo de exposição, 3 s; velocidade de deslocamento vertical, 16,25 μs; taxa de leitura horizontal, 33 kHz. Os espectros adquiridos foram coletados usando o modo Binning Vertical Total e foram corrigidos em segundo plano. Uma combinação dos filtros passa-banda de 240-400 nm, passa-curto de corte de 300 nm e filtro de passa-curto de corte de 325 nm foi usada para selecionar a luz de excitação. A análise de aquisição de dados foi realizada no programa Andor Solis (Andor Technologies). Os espectros de emissão de FLEC ‐ AAs registrados com wrFlu mostraram um comprimento de onda de emissão máximo de cerca de 332 nm,45 . Como descrito por de Kort et al. 53 , essa diferença é causada por uma transmitância um pouco reduzida dos comprimentos de onda UV abaixo de 315 nm da óptica do detector (cone óptico e fibra de emissão).

2.3 Preparação da amostra e derivatização de aminoácidos com cloroformato de (+) - 1‐ (9 ‐ fluorenil) etil

A derivação de AAs com FLEC foi realizada adicionando 50 μL de 18 mM (+) - FLEC a 50 μL de dl ‐ AA em tetraborato de sódio 5 mM (pH 9,2). A solução foi agitada por dois minutos, seca e reconstituída em 50 μL de acetonitrila / água (1: 1, v / v). Após dez vezes a diluição com água, a amostra estava pronta para injeção. O rendimento da derivatização da FLEC foi avaliado comparando-se as análises de dl ‐ triptofano derivatizado e subivatizado na faixa de concentração de 40 a 600 μM usando MEKC – UV. O rendimento da derivatização foi calculado com base na área de pico observada a 280 nm para dl ‐ triptofano subivatizado antes e após a derivatização da FLEC. O rendimento foi de 93 a 97%, indicando uma boa eficiência de derivatização de dl–AAs nas condições aplicadas.

3.1 Detecção de fluorescência excitada por UV de aminoácidos derivatizados

No trabalho anterior de CE-UV e CE-MS nos FLEC-AAs 26 , 28 , usamos capilares de sílica fundida nua com um ID de 50 μm. No presente estudo, empregamos capilares de 75 μm id para aumentar o comprimento do caminho óptico para excitação. Capilares com um ID maior que 75 μm resultaram em correntes CE excessivas (acima de 100 μA) ao aplicar tensão de separação de 20–30 kV. Para alcançar S / Ns ótimos para FLEC ‐ AAs, foram avaliados os efeitos dos filtros de excitação, integração do sinal, largura da fenda do espectrógrafo e tempo de exposição do CCD. Vários filtros de excitação e suas combinações foram avaliados: um filtro de passagem ampla de 240 a 400 nm, um filtro de passagem de banda de 260 nm e dois filtros de passagem curta com um limite de 300 e 325 nm. Análise de 25 μM de FLEC- dlA asparagina foi realizada usando uma BGE de tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2). O S / N do pico de asparagina obtido com os diferentes filtros de excitação e suas combinações está representado na Figura  1. Ao usar os filtros de excitação separadamente, os S / Ns da asparagina estavam na faixa de 6 a 20. O S / N relativamente pobre obtido apenas com o filtro passa banda de 260 nm, resultou da transmitância limitada do filtro e do fato de que apenas uma pequena parte do espectro de excitação FLEC-AA foi empregada para induzir fluorescência. Os filtros de passagem ampla e passagem individual forneceram maior intensidade de fluorescência devido à excitação ampla do FLEC-AA, mas também níveis de ruído relativamente altos, levando a um S / N baixo geral. O filtro de passagem ampla de 240–400 nm e o filtro de passagem curta de 325 nm transmitem luz na região de emissão do FLEC ‐ AA, causando ruído adicional. Embora o filtro de passagem curta de 300 nm bloqueie eficientemente a luz na faixa de comprimentos de onda de 300 a 360 nm, mostrou uma transmitância considerável acima dessa faixa, resultando em ruídos graves no sinal de emissão. S / Ns significativamente mais altos (189–252) para o FLEC ‐ AA foram obtidos quando combinações dos filtros de excitação foram usadas (Figura 1 ) O S / N ideal (252) foi obtido ao combinar os filtros de passagem rápida de 240–400 nm e os filtros de passagem curta de 300 e 325 nm, que permitiram a excitação em banda larga do FLEC ‐ AA, enquanto impediam com eficiência a interferência da luz de excitação com emissão FLEC-AA.

O detector wrFlu fornece uma coleção de espectros de emissão ao longo do tempo. Um eletroferograma pode ser construído plotando a luz de emissão FLEC-AA na emissão máxima (332 nm), mas obviamente apenas uma pequena parte da emissão medida será utilizada. Empregando o conjunto de dados completo, a integração da intensidade de emissão em um determinado intervalo de comprimento de onda pode ser realizada para cada ponto medido no tempo, o que pode melhorar os valores de S / N 53 . Eletroferogramas extraídos foram construídos a partir do conjunto de dados wrFlu obtido para l ‐ valina e l-Isoleucina usando um BGE de tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2). Os sinais obtidos foram integrados usando intervalos crescentes de comprimento de onda. O S / N dos FLEC ‐ AAs foi determinado para cada um dos eletroferogramas construídos e plotados contra a largura do intervalo de comprimento de onda, como representado para l ‐ valina na Figura  2. O sinal de emissão total aumentou primeiro significativamente com a expansão do intervalo do comprimento de onda, enquanto o ruído total aumentou em menor extensão. Como resultado, o S / N melhorou quando o intervalo de comprimento de onda foi aumentado, até que o nível de crescimento diminuísse a uma largura de 20 nm. Para intervalos de comprimento de onda de 20 a 30 nm, o S / N permanece constante. Nesse ponto (faixa de comprimento de onda integrada de 317 a 347 nm), o S / N era dez vezes maior em comparação ao uso de um intervalo de comprimento de onda de 1 nm em torno de 332 nm. Acima de uma largura de 30 nm, o S / N diminui à medida que o ruído total continua aumentando enquanto a intensidade de emissão integrada não é.

Para otimizar ainda mais a sensibilidade da detecção, a largura da fenda do espectrógrafo e o tempo de exposição do CCD foram variados. A largura da fenda da luz de emissão do espectrógrafo afeta a intensidade do sinal e a resolução óptica alcançável. Analisando 25 μM de FLEC- dl‐Asparagina usando tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) como BGE, a largura da fenda foi testada na faixa de 50–1300 μm. Aumentar a largura da fenda em até 500 μm proporcionou um aumento significativo da intensidade do sinal de pico da asparagina e um ruído moderadamente maior, resultando em uma melhoria de até 14 vezes o S ​​/ N em comparação com uma largura de fenda de 50 μm. O aumento da largura da fenda acima de 500 μm não melhorou ainda mais o S ​​/ N. Como a alta resolução espectral não é necessária para o presente método - os espectros de emissão dos AAs derivados da FLEC são praticamente os mesmos - mas a sensibilidade é essencial, uma largura de fenda relativamente grande de 500 μm foi selecionada.

O tempo de exposição do CCD, o tempo em que a luz é coletada antes da leitura do CCD, deve ser o maior possível para o S / N ideal. Como o detector será usado para monitorar a separação CE, o tempo de exposição obviamente será limitado pela resolução do tempo (ou seja, taxa de amostragem do ponto de dados) necessária para registrar corretamente o eletroferograma. O tempo de exposição foi testado para a análise de 25 μM de FLEC- dl- asparagina usando tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) como BGE. No geral, o aumento do tempo de exposição (até 5 s) resultou em melhores S / Ns para o pico de asparagina. Como um compromisso entre sensibilidade e eficiência de separação, um tempo de exposição de 3 s foi selecionado.

A sensibilidade de detecção obtida com o sistema wrFlu, incluindo a câmera CCD, foi comparada com o detector Argos Flu original, empregando um fotomultiplicador (PMT) para a detecção da luz emitida. Para a excitação, foi usada a mesma combinação de filtros de excitação (por exemplo, filtros de banda larga de 240 a 400 nm e filtros de passagem curta de 300 e 325 nm). Para selecionar a luz de emissão apropriada, foram testados três filtros de passagem longa (cut-off, 305, 320 e 335 nm). Utilizando FLEC- dl- asparagina 25 μM para análise e tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) como BGE, os valores S / N mais altos e similares do pico de asparagina foram alcançados com os filtros de emissão de passa longa de 305 e 320 nm. Usando o filtro passa-longa de 335 nm, foram obtidos S / Ns duas vezes mais baixos. O filtro passa-longa de 305 nm foi selecionado para a comparação. Para isso, 25 μM FLEC‐A dl‐ asparagina foi analisada por CE-wrFlu empregando o detector CCD e por CE-Flu empregando o detector PMT sob condições de separação idênticas. O S / N (2519) obtido com o CCD empregando a integração do intervalo de comprimento de onda de emissão foi cerca de 23 vezes maior que o S / N obtido com o detector PMT (109). O sistema wrFlu foi usado para outras experiências.

3.2 Otimização de separação

Com base em nossos experimentos MEKC – UV anteriores com FLEC ‐ dl ‐ AAs 33 usando derivação em linha, um BGE de tetraborato de sódio contendo SDS e isopropanol foi selecionado como ponto de partida. Como no diâmetro e comprimento capilar do sistema CE – Flu, e as condições de injeção e termostato foram diferentes, cada um dos componentes da BGE foi avaliado brevemente quanto a seu efeito na enantio e quimiosparação dos dl ‐ AAs. Para a otimização da separação, foi utilizada uma mistura de teste de seis dl ‐ AAs (asparagina, glutamina, treonina, serina, isoleucina e leucina).

Variações da concentração de tetraborato de sódio (10-40 mM, pH 9,2) e SDS (0-90 mM) na BGE, mantendo a porcentagem de isopropanol constante (15%, v / v) mostraram que o aumento da concentração de tampão e SDS resultou em melhor enantio e quimiosparação. Além disso, o aumento da concentração de SDS levou a maiores tempos de separação. Por exemplo, aumentar a concentração de SDS no tetraborato de sódio 10 mM (pH 9,2) de 0 para 90 mM aumentou o tempo de separação de 17 para 33 min. O aumento prático do tampão tetraborato de sódio e a concentração de SDS foram limitados, pois concentrações mais altas de tampão (> 40 mM) e SDS (> 90 mM) levaram a correntes CE excessivas superiores a 110 μA. Variando a concentração do tampão de tetraborato de sódio juntamente com as concentrações de SDS, a melhor separação geral foi observada quando se utilizou um BGE de tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) com SDS 25 mM e isopropanol a 15%. Com este BGE, todos os testes FLEC‐Os dl ‐ AAs foram enantioseparados enquanto a quimiossíntese foi alcançada para todos, exceto asparagina e glutamina, que comigraram.

O conteúdo de isopropanol na BGE foi testado (10–25%, em etapas de 5% v / v) quanto a seu efeito na quimio e enantioresolução. O uso de 20% e 25% de isopropanol no BGE v / v resultou em longos tempos de migração, picos amplos e diminuição das enantioresoluções. Quando 10% de isopropanol no BGE v / v foi testado, os analitos migraram relativamente rápido e a maioria deles co-migrou. O teor de isopropanol na BGE de 15% v / v foi considerado ideal com a enantioseparação de todos os FLEC- dl testados-AAs. O acetonitrilo e o metanol foram testados como solventes orgânicos alternativos na BGE. Em porcentagens de volume de 15 a 25% no BGE v / v, foram observados desempenhos de separação semelhantes (quimio e enantioresolução) como no isopropanol, embora com maior corrente CE (110 e 120 μA, para 15% v / v de metanol e acetonitrila) na BGE, respectivamente). Testar um baixo teor de metanol e acetonitrila na BGE levou a correntes CE excessivas. Portanto, 15% de isopropanol no BGE v / v foi selecionado. No geral, as condições ideais de separação foram semelhantes às obtidas anteriormente para MECK – UV 26, embora alguns ajustes na concentração de SDS e isopropanol fossem necessários. Provavelmente, isso se deve ao fato de grande parte do capilar não ter sido termostatizada ao usar a detecção de gripe e nenhuma derivação em linha foi aplicada. Além disso, a otimização do método anterior foi apresentada apenas para três AAs, e as concentrações ótimas foram um comprometimento.

O estudo do efeito do pH do buffer (8,0-10,5) no desempenho da separação não mostrou diferenças significativas na quimio e enantioresolução em vários valores de pH, provavelmente porque a faixa de pH testada estava bem acima do p I dos AAs derivatizados. Um pH de 9,2 foi mantido para outras experiências, uma vez que não era necessário ajuste do pH do tampão após a preparação.

Posteriormente, a viabilidade do BGE otimizado (tetraborato de sódio 40 mM (pH 9,2) contendo SDS 25 mM e isopropanol 15% v / v) foi testada quanto à enantioseparação dos 19 AAs proteogênicos quirais. Sob essas condições, 12 dl ‐ AAs foram bem-sucedidos com resoluções de 1,2 a 7,9 (Figura  3 ; Tabela  1 ). Dos outros AAs, prolina e ácido glutâmico foram detectados aos 19 e 24 min, respectivamente, mas não enantioseparados. A FLEC- dl- prolina deu um pico (sem separação quiral) com uma forma pobre. Muito provavelmente, a funcionalidade amina secundária da prolina afeta a orientação espacial da fração FLEC no AA e, portanto, a separação MEKC dos diastereômeros resultantes. FLEC‐ dlO ácido glutâmico não foi enantioseparado, provavelmente devido à sua carga dupla negativa, impedindo sua partição na fase micelar SDS-carregada negativamente. FLEC- dl- ácido aspártico, lisina, cisteína, histidina e tirosina não foram detectados em 60 minutos de análise. Como o ácido aspártico tem propriedades semelhantes ao ácido glutâmico, esperávamos que ele migrasse em 40 minutos. Portanto, especulamos que ele comigrou com o FLEC que não reagiu (pico alto aos 27,5 min). A lisina, a cisteína, a histidina e a tirosina transportam duas moléculas de FLEC após a derivatização 54 - 56 , o que resulta em uma hidrofobicidade fortemente aumentada e, portanto, na afinidade com as micelas, causando tempos de migração acima de 60 min. Dos 12 dl- Como os enantiosseparados dentro de 60 minutos de tempo de execução, os enantiômeros de asparagina e glutamina comigraram (Figura 3 A e B), enquanto a arginina e o triptofano tiveram um de seus enantiômeros emigrando (ou seja, sem quimiosparação completa; Figura   3 A e C). A FLEC-asparagina e a FLEC-glutamina têm, de fato, um índice de hidropatia semelhante (-3,5) 57 e, portanto, podem não ser separadas por MEKC.

3.3 Desempenho do método

Os LODs (concentração injetada produzindo um S / N de 3) determinados para os FLEC ‐ AAs estavam na faixa de 13–60 nM, com exceção da dl ‐ arginina (156 nM) e dl ‐ triptofano (580 nM) (Tabela  1 ) A arginina e o triptofano migraram relativamente lentamente (34–39 min) e mostraram picos ampliados (Figura 3 A e C), resultando em menores S / Ns. Além disso, o LOD para FLEC- dl- triptofano provavelmente também está comprometido pelo resfriamento intramolecular da emissão da molécula de FLEC pela porção indol do triptofano. Um efeito semelhante foi relatado para o FMOC ‐ triptofano 58 .

A detecção de wrFlu foi comparada à detecção de absorvância UV para avaliar o ganho de sensibilidade obtido com a detecção de wrFlu. Utilizando detecção de absorbância UV, um capilar de 43,9 cm (comprimento efetivo de 33,2 cm) e uma tensão de separação de 18 kV foram empregados, de modo que a relação capilar total / efetiva e a força do campo elétrico fossem as mesmas do sistema wrFlu. O volume de injeção da amostra foi mantido em cerca de 1% do volume capilar nos dois sistemas. Comparando os LODs obtidos para os dois métodos (Tabela  1 ), uma sensibilidade claramente melhor (fator 27–100) foi obtida para a maioria dos FLEC ‐ AAs ao usar o detector wrFlu. Para triptofano e arginina, foram obtidos ganhos menores (fator 7 e 13, respectivamente). Figura  4ilustra que o método MEKC-Flu é claramente capaz de detectar d -AAs no 50-200 nM injectado gama de concentrações, que é correspondente à injectados d concentrações -AA que podem ser esperados para as amostras biofluid, tais como líquido cerebrospinal, após pré-tratamento da amostra (isto é, derivatização e diluição) 35 , 59 , 60 .

O método CE-Flu otimizado foi avaliado em relação à repetição da área do pico e do tempo de migração. Os valores de RSD para a área de picos corrigidos e os tempos de migração foram de 0,3 a 2,6% e de 0,3 a 1,9, respectivamente ( n  = 6). Para avaliar a linearidade do método, uma mistura de dl ‐ treonina, dl ‐ isoleucina e dl ‐ fenilalanina (representando AAs de migração rápida, média e lenta) foi derivatizada em nove concentrações variando de 40 a 3600 nM (concentração injetada) por enantiômero. Cada solução foi derivatizada individualmente antes da análise. Observou-se a linearidade para a concentração satisfatória área de pico vs. injetada para todos os AAs testados com coeficientes de determinao ( R ² ) acima 0,985 (Tabela  2) Esses resultados mostram a adequação do método proposto para a detecção seletiva de d ‐ AAs.