ACT

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161633595X

Volume 24, edição 8 , agosto de 2016 , páginas 1435-1443

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Artigo original

https://doi.org/10.1038/mt.2016.137 Obtenha direitos e conteúdo

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Arquivo aberto

A transferência de células T adotiva é uma abordagem de tratamento promissora para o câncer metastático, mas a eficácia em tumores sólidos só foi alcançada com esquemas de pré e pós-condicionamento tóxicos. Assim, as terapias adotivas de células T se beneficiariam de modalidades complementares que permitissem seu pleno potencial sem toxicidade excessiva. Nosso objetivo foi melhorar a eficácia e a segurança da transferência de células T adotivas usando vetores adenovirais para a entrega direta de citocinas murinas imunomoduladoras em tumores de melanoma B16.OVA com a transferência de células T OT-I transgênica de receptor de células-T concomitante . Adenovírus armados expressaram altos níveis sistêmicos locais e baixos citocina quando injetada em tumores B16.OVA, sugerindo segurança na entrega de citocinas mediada por vírus . A eficácia antitumoral foi significativamente aumentada com os adenovírus que codificam a interleucina-2 murina (mIL-2) e o factor de necrose tumoral-a (mTNFa) quando comparados com a transferência de células T sozinha ouapenas comvírus. Melhoria adicional na eficácia foi conseguida com uma combinação tripla de células T mIL-2, mTNFa e OT-I. Estudos mecanísticos sugerem que o mIL-2 tem umpapelimportante na ativação de células T no tumor, enquanto o mTNFα induz a quimiocinaexpressão. Além disso, os tratamentos de adenovírus reforçada tumoral-a infiltração de OT-I de células T, como demonstrado pela SPECT / CT de¹¹¹In-marcadascélulas. Nossos resultados sugerem a utilidade de adenovírus codificadores de citocinas para melhorar a eficácia de terapias adotivas de células T.

Introdução

A imunoterapia contra o cancro com a transferência adoptiva de linfócitos infiltrantes de tumores (TIL), receptores de células T (TCR) ou células T construídas com receptores de antigénios quiméricos ganhou força nos últimos anos. ¹Respostas duráveis foram observadas com o receptor de antígeno quiméricodirecionado por CD19 em malignidades de células B , ² TILs autólogas em melanoma metastático³ , bem como TCR dirigido contra antígenos de melanoma. ⁴,⁵ No entanto, a eficácia do receptor de antígeno quimérico contra tumores sólidospermanece insatisfatória ⁶ ,⁷e as toxicidades estão associadas ao pré -condicionamento sistêmico com altas doses de quimioterapia e ao pós-condicionamento com interleucina-2 (IL-2) freqüentemente usado em esquemas TIL / TCR. Importante, as células infundidas enfrentam um microambiente tumoral imunossupressor que impede suas funções efetoras. ⁸ Esse problema deve ser resolvido para terapia celular adotiva (TCA) bem-sucedida e segura em tumores sólidos .

As citocinas imunomoduladoras podem induzir respostas imunes antitumoraisquando usadas como agentes únicos ⁹ ou codificadas por vetores adenovirais . ¹⁰ ,¹¹ ,¹² ,¹³ ,¹⁴A última abordagem tem a vantagem de altas concentrações locais versus baixas concentrações sistêmicas, com óbvia relevância tanto para a segurança quanto para a eficácia, tendo em mente que são órgãos normais que são responsáveis por eventos adversos enquanto a eficácia ocorre em o tumor. Além do bem estabelecido uso concomitante de IL-2 com transferência de TIL, apenas algumas outras citocinas foram estudadas em combinação com células T adotivas .transferir. Em um recente estudo clínico de fase 1/2, injeções intralesionais de adenovírusexpressando interferon gama (IFNg) combinadas com infusão de TIL demonstraram a viabilidade da abordagem de combinação. ¹⁵ Pré-clinicamente, as citocinas imunomoduladoras (não vetorizadas) têm sido usadas para permitir a transferência efetiva de TCR nomelanoma murino . ¹⁰ ,¹¹ ,¹² ,¹⁶

Neste estudo, construímos adenovírus não-replicantes que codificam citocinas e testamos sua capacidade de melhorar a transferência adotiva de células T para o melanoma. Nós hipotetizamos que a produção local de citocinas imunoestimuladoras a partir de vetores adenovirais poderia promover a função das células T transferidas de forma adotiva para melhorar o resultado terapêutico. mTNFa e mIL-2 emergiram como citoquinas eficazes quando acopladas com células T transgénicas OT-I TCR para o tratamento de melanoma murino B16.OVA, com indicações de que a combinação dupla de citoquinas contrariava a imunossupressãotumoral no contexto da transferência de células T. Nossos resultados apóiam odesenvolvimento de adenovírus armados com citocinas comopotenciadores de terapias de células T adoptivas para tumores sólidos. Especificamente, esses resultados estabelecem as bases para um ensaio clínico em humanos que está sendo desenvolvido pela TILT Biotherapeutics.

Resultados

Adenovírus armados expressam citocinas murinas biologicamente ativas in vitro

Os transgenes foram colocados sob o promotor do citomegalovírus humano para expressão constitutiva de citocinas murinas( Figura 1a). Para confirmar a expressão,sobrenadantes deculturas de célulasinfectadas por vírusforam analisados para citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA) após um período de incubação de 48 horas(Figura 1b). Concentrações decitocinas produzidasin vitrovariaram de 750 pg / ml (mIL-2) a 1.500 pg / ml (mTNFa). A funcionalidade das citocinas foi confirmada com bioensaios (Figura Suplementar S1). Em conclusão, todos osvírusproduzidos biologicamente ativoscitocinas murinas in vitro.

A injeção intratumoral de vírus resulta em altos níveis locais e baixos de citocina sistêmica

Para a avaliação da in vivo de expressão do transgene, tumores B16.OVA foram injectados intratumoralmente com citocinas armado adenovus (1 x 10 ⁹VP / tumor). O tumor e o soro foram analisados 72 horas depois quanto ao teor de citocinas ( Figura 1c - f ). Para todos os vírus , a expressão local do transgene foi observada. De uma perspectiva de segurança, vale ressaltar que níveis muito baixos de citocinas foram detectados no soro.

Adenovírus armados com citocinas combinados com a transferência adotiva de células T inibem o crescimento de tumores B16.OVA

A eficia antitumoral de adenovus combinado com culas OT-I foi estudada emratinhos C57BL / 6 com tumores B16.OVA estabelecidos ( Figura 2 ). Os animais receberam uma única administração de 1.5 x 10⁶células T OT-I enriquecidas com CD8 + e injeções semanais de adenovírus (1 × 10⁹VP / injeção). O tratamento com células T OT-1 apenas moderadamente suprimiu o crescimento tumoral ^16, mas quando combinado com Ad5-CMV-mIL2, melhorou significativamente o controle do crescimento tumoralfoi observada quando comparada com ambos os agentes únicos e controle não tratado (combinação versus Ad5-CMV-mIL2, P <0,05; combinação versus OT-I, P <0,01; combinação versus simulação, P <0,001) ( Figura 2a ). A combinao de culas T Ad5-CMV-mTNF? E OT-I inibiu o crescimento tumoralsignificativamente em OT-I e simulado sozinho (combinao versus OT-I, P <0,05; combinao versus simulado, P <0,001) e uma tendcia para melhor eficácia foi observada sobre o vírus sozinho (combinação versus Ad5-CMV-mTNFα, P = 0,06) ( Figura 2b ). Ad5-CMV-mIFNg combinado com transferência de OT-I resultou emsupressão do crescimento que foi significativa em comparação com o vírus isolado e simulado (combinação versus Ad5-CMV-mIFNg, P <0,01; combinação versus simulação, P <0,01), mas não superior a OT-I sozinho ( Figura 2c ). Para Ad5-CMV-IFNb, a adição de células T OT-I não melhorou a eficácia antitumoral (combinação versus Ad5-CMV-mIFNb, P = ns), mas foi superior a simulação (combinação versus simulação, P <0,001) ( Figura 2d ).

A combinação dupla de Ad5-CMV-mTNFα e Ad5-CMV-mIL2 com transferência de células T é superior às monoterapias contra B16.OVA

A partir de expericias iniciais realizadas com adenovus individuais armados com citocina ( Figura 2 ), emergiram duas citocinas como os candidatos mais promissores para estudos adicionais (mTNF? E mIL-2). Os vírus que codificam essas citocinas foram posteriormente combinados em uma proporção de 1 para 1, juntamente com a transferência de células T OT-I para a avaliação da eficácia antitumoral. Curiosamente, a combinação dupla de Ad5-CMV-mTNFα / Ad5-CMV-mIL2 (0,5 × 10 ⁹ VP cada) com OT-I (1,5 × 10 ⁶ células) foi superior ao vírus mTNFa combinado com OT-I ( Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I versus Ad5-CMV-mTNFa + OT-I, P <0,05), o vírus armado com mIL2 combinado com OT-I (Ad5-CMV-mTNFa / Ad5- CMV-mIL2 + OT-I versus Ad5-CMV-mIL2 + OT-I, P<0,001) e tratamento com OT-I sozinho (Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I versus OT-I, P <0,001) ( Figura 3 ).

Infiltrados de linfócitos em tumores B16.OVA após tratamento com adenovírus armados e transferência de OT-I

Em seguida, examinamos os tumores do endpoint B16.OVA em busca de pistas sobre o mecanismo de ação por trás da eficácia antitumoral aumentada ( Figura 4 ). Em primeiro lugar, a percentagem de células T CD4 + e CD8 + nos tumores foi analisada por citometria de fluxo . A maior percentagem (11%) de células T CD4 + foi observada em tumores tratados com Ad5-CMV-mIL2 + OT-I ( Figura 4a ). Os grupos de tratamento que receberam apenas Ad5-CMV-mIL2, Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 apenas e Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I compreenderam 5–6% de CD4 + T infiltrantes de tumores -células O CD4 mais baixoos níveis (1% de todas as células) foram observados apenas nos grupos OT-I, Ad5-CMV-mTNFa e Ad5-CMV-mTNFa + OT-I. A maior percentagem de células T CD8 + (5% de todas as células) foi observada nos grupos Ad5-CMV-mIL2 e Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I ( Figura 4b ). O estado de activação das células T infiltrantes de tumores após o tratamento foi determinado por coloração com CD69 de TIL positiva para CD3 ( Figura 4c ). Curiosamente, a combinação dupla de citocinas (mais células OT-I) resultou em uma proporção maior de células T ativadas do que no grupo controle OT-I (Ad5-CMV-mTNFα / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I versus OT- Eu, P <0,05). Células T Regulamentares(Treg) foram moderadamente aumentados em tumores tratados com a combinação tripla de Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I quando comparados com outros grupos de tratamento ( Figura 4d ). Além das células T, a infiltração de células B foi aumentada em tumores tratados com vírus codificadores de mIL2 ( Figura 4e ). Observou -se um aumento nas culas assassinas naturais (NK) que se infiltraram no tumor nos grupos de tratamento Ad5-CMV-mIL2 + OT-I e Ad5-CMV-mTNFa / Ad5-CMV-mIL2 + OT-I ( Figura 4f ). Finalmente, foram observados baixos níveis de macrófagos M2 imunossupressores em tumores tratados com combinações de vírus e células T armados com citocina, quando comparados com os vírus codificadores mTNFα e mIL2 (Figura S2a suplementar ), e o número de células dendríticas maduras (DC), como determinado pela expressão de CD86 na superfície celular , foi aumentado nos tumores tratados com Ad5-CMV-mIL2 + OT-I ( figura suplementar S2b ).

A via PD1 / PD-L1 em tumores B16.OVA é afetada pelo tratamento com adenovírus

Em estudos mecanísticos adicionais, examinamos a via do ponto de verificação imunológico envolvendo morte celular programada 1 (PD1) e seu ligante PD-L1 em B16.OVA. A transferência de OT-I sozinha resultou em expressão positiva significativa da expressão de PD-L1 em comparação com tumores simulados não tratados e este efeito foi ainda aumentado pela adição de injeções de adenovírus codificando citocinas ( Figura 5a ). Curiosamente, o tratamento com Ad5-CMV-mIL2 + OT-I resultou numa tendência para a regulação negativa da PD1 nas células T CD8 + infiltrantes do tumor ( Figura 5b ).

O mTNFα entregue por vírus induz a expressão de quimiocinas em tumores

A expressão das quimiocinas RANTES , MCP1, MIP-1a, MIP-1b, MIG e I-TAC foi estudada em lisados tumorais B16.OVA homogeneizados ( Figura 5c ). Quando os resultados individuais de quimiocinas foram reunidos, o tratamento de combinao com Ad5-CMV-mTNFa + OT-I mostrou uma regulao positiva significativa destas molulas quando comparado com OT-I sozinho ( P <0,0001) e Ad5-CMV-mIL2 + OT-I ( P <0,05).

O tratamento com adenovírus aumenta a infiltração tumoral de células T radiomarcadas em SPECT / CT imaging

A expressão aumentada de quimiocinas observada em tumores tratados com vírus levou-nos a estudar a dinâmica de migração de células T OT-I adotivamente transferidas. Para este fim, ¹¹¹OT-I células T In-marcada foram administrados a portador de tumor B16.OVA ratinhos com injecções de adenovírus simultâneas ( Figura 6 ). Curiosamente, a imagem SPECT / CT dos camundongos revelou uma acumulação significativa de células T radiomarcadas nos tumores de camundongos tratados com Ad5-CMV-mTNFα / Ad5-CMV-mIL2 em comparação com camundongos tratados simulados ( P = 0,03) 96 horas após início do tratamento ( Figura 6a ). Os vírus que codificam apenas a citocina também foram capazes de induzir a migração de células OT-Itumores, mas as diferenças não foram estatisticamente significantes. Imagens de SPECT / CT representativas de dados de imagem de 96 horas são mostradas na Figura 6b .

Discussão

Transferência Adoptiva de células T é uma modalidade de tratamento promissora para o câncer avançado. No entanto, dada a sua baixa eficácia em tumores sólidos , especialmente se o pré e pós-condicionamento tóxico não for utilizado, abordagens complementares que permitam o potencial total da abordagem são necessárias. Para este fim, construímos adenovírus murinos , armados com citocinas, que foram utilizados em conjunto com a transferência de células T OT-I para tratar o melanoma B16.

A expressão constitutiva de citocinas murinas de adenovírus não replicanteshumanos baseados em sorotipo 5 foi confirmada in vitroein vivo. O TNFα foi inicialmente identificado como uma das moléculas mais potentespara destruir tumores. ¹⁷ Subsequentemente, também foi descoberto que pode mediar importantes efeitos imunológicos antitumorais. ¹⁴ ,¹⁸ No entanto, ensaios clínicos comTNFαsistêmico recombinante resultaram em efeitos colaterais significativos, estando a hepatotoxicidade e a hipotensão entre as mais comuns, enquanto as respostas tumorais têm sido raras. ¹⁹Assim, a administração sistémica de TNFa resulta em toxicidades significativas fora do alvo, que limitam a concentração que pode ser conseguida no tumor, resultando em baixa eficácia. Portanto, o TNFα recombinante é atualmente usado apenas na perfusão isolada do membro, o que restringe fisicamente a exposição sistêmica. ²⁰

Uma abordagem mais sofisticada para melhorar os níveis locais e sistêmicos do TNFα é a entrega vetorial. Isso pode ser efetivamente alcançado com adenovírus armados, como mostramos com Ad5-CMV-mTNFα; a produção de citocinas foi restrita aos tumores injetados intratumoralmente enquanto os níveis séricos de mTNFα foram insignificantes. Uma vez que os vectores protovï¿½icos adenovirais (codificantes para transgenes murinos) utilizados neste estudo nï¿½ possuem especificidade para cï¿½ulas tumorais , ï¿½provï¿½el a expressï¿½ de citoquinas a partir de cï¿½ulas nï¿½ tumorais . No entanto, no caso de adenovírus oncolíticos competentes para replicação , que expressam transgenes humanose que replicam seletivamente em células tumorais defeituosas na via p16 / Rb, a expressão de ²¹ citocinas mostrou-se restrita a tumores sem exposição sistêmica. ²²

O fornecimento a partir de uma plataforma oncolítica é uma abordagem ideal para alcançar altos níveis agudos de TNFα no tumor. Não apenas a expressão do transgene está ligada à replicação do vírus , que ocorre apenas em tumores, mas a plataforma de produção do transgene, o genoma do vírus , é amplificada localmente enquanto as células tumorais viáveis permanecem, e então desligadas. A expressão sustentada de longo prazo do TNFα está associada à carcinogênese ^23, enquanto a expressão de curto prazo e dinâmica pode induzir respostas imunes . ¹⁸ , ²⁴Infelizmente, os problemas de incompatibilidade de espécies impedem o uso de adenovírus humanos competentes para replicação em camundongos ^25.necessitando, assim, do desenvolvimento de protótipos de vetores não replicantes e não-seletivos para estudos pré-clínicos , como os realizados em nosso trabalho.

A administração de IL-2 tem sido extensivamente estudada como terapia de agente único e em combinação com transferência TIL adotiva no tratamento do melanoma. ²⁶ sistemicamente administradas doses elevadas de IL-2 em conjunto com o pré-condicionamento lymphodepletion e infusão TIL pode conduzir a taxas de resposta elevados, mas é acompanhada por toxicidade atribuída a síndrome de perda vascular induzida por IL-2. ²⁷Em contraste com a toxicidade, que ocorre sistemicamente em órgãos fora do alvo, os efeitos úteis se a IL-2 no enxerto de células T ocorrer localmente no tumor e próximo dele. Portanto, minimizar a exposição sistêmica através da administração local de IL-2 parece preferível. Tal como com o Ad5-CMV-mTNFa, os nossos dados sobre o Ad5-CMV-mIL2 injectado intratumoralmente indicam que podem ser conseguidos níveis locais elevados de citocina com um mínimo de fuga para a circulação . Em relao traduo clica, a construo de adenovus competentes para replicao codificando IL-2 humana (ou outras citoquinas humanas) poderia produzir um perfil de seguran comparel devido express de citoquina restrita a tumor embora isto ainda deva ser provado.

Os efeitos antitumorais da transferência de células T combinados com injeções de vírus locais foram avaliados no modelo de melanoma B16.OVA de camundongo . Mostramos que a eficácia antitumoral contra o melanoma altamente agressivo e imunossupressor - semelhante a muitos melanomas humanos - pode ser alcançada com a combinação de células T OT-I e injeções semanais de Ad5-CMV-mIL2 ou Ad5-CMV-mTNFa sem toxicidade aparente. Anteriormente, os vetores adenovirais que codificam a IL-2 mostraram eficácia em modelos pré-clínicos em camundongos de câncer de mama ,²⁸ mastocitoma,²⁹ fibrossarcoma³⁰ e carcinoma de tireoide. ³¹Um ensaio clínico de fase 1 com IL-2 mediada por adenovírus em câncer de mama metastático e melanoma não induziu respostas clínicas, mas o tratamento foi bem tolerado. ³² Mais recentemente, a atividade clínica foi observada em 17% dos pacientes tratados intralesionalmente com o vírus codificador de IL-2 (TG1024), e os tratamentos foram seguros. ³³ Regressões tumorais significativas também foram observadas com adenovírus codificadores de TNFα pré-clinicamente ¹⁴ , ³⁴ e em pacientes com tumores sólidos avançados . ³⁵ É digno de nota que o TNFα e a IL-2 recombinantes parecem atraentes para o aprimoramento da terapia celular adotiva. ³⁶Juntamente com estes relatórios anteriores, os nossos dados apoiam a noção de que os adenovírus codificadores de IL-2 e TNFa têm potencial traducional no contexto de permitir uma terapia segura e eficaz de células T de humanos com tumores sólidos incuráveis atualmente.

Para melhorar ainda mais a eficácia antitumoral, combinamos as duas citocinas mais promissoras das experiências iniciais, isto é , mIL-2 e mTNFα, com a transferência simultânea de células T OT-I. Com o Ad5-CMV-mIL2 e o Ad5-CMV-mTNFα misturados, o crescimento dos tumores B16.OVA foi significativamente reduzido quando comparado com as terapias com agente único. Além disso, nenhuma morte relacionada ao tratamento foi observada nos dois grupos de citocinas, indicando que o tratamento foi bem tolerado. Nossos dados estão de acordo com estudos anteriores que revelaram uma relação sinérgica entre IL-2 recombinante e TNFα contra vários tumores murinos. ³⁷ , ³⁸ Com relação ao mecanismo de ação, nossos dados sugerem que o TNFα tem um papel no recrutamento de células T(através da indução da expressão de quimiocinas ) que é reforçada pela adição de IL-2, como mostrado na experiência de imagem por SPECT / CT. Pesquisas anteriores apóiam nossas observações, já que o TNFα direcionado ao tumor tem mostrado aumentar a infiltração de linfócitos e a terapia adotiva com células T. ³⁹,^{40 O}TNFα também pode ser importante no combate à imunossupressão, incluindomacrófagosM2, quando usado em combinação com a terapia com IL-2 e células-T. Também pode ser relevante que o TNFα tenha sido sugerido para suprimir a função reguladora das células T. ⁴¹Em humanos, no entanto, não foram observados efeitos antitumorais com citocinas administradas sistemicamente, nem o tratamento combinado foi bem tolerado. ⁴²A discrepância entre os dados de humanos e de camundongos ressalta a dificuldade de se traduzir os resultados de roedores diretamente em humanos, uma das causas das quais é a maior habilidade do primeiro em sustentar doses que seriam letais no segundo. Além disso, esses dados enfatizam a utilidade da produção local de citocinas , pois permite que concentrações locais efetivas sejam obtidas com exposição sistêmica limitada. Claramente, apenas dados humanos podem, em última análise, determinar a viabilidade de combinar adenovírus codificadores de IL-2 / TNFa com transferência de célula T adotiva.

O duplo papel da IL-2 como promotor e inibidor de respostas imunitárias antitumorais está bem estabelecido. ⁴³ Concordantemente, a pesquisa prévia com recombinante de murino IL-2 e OT-I no modelo B16.OVA revelou que antitumoral simultâneo ( isto é , células dendríticas de activação) e imunossupressores ( ou seja , vias Tregs) parecem ser induzido com IL-2 (ref.³⁶ ). De acordo com estas observações estão relatórios em que os tumores B16 transduzidos por IL-2 exibiram um melhor controlo do crescimento do tumor e aumentaram as células NK e as células T efectoras apesar do aumento das células T reguladoras que se infiltram. ⁴⁴Nas expericias aqui descritas, os tumores B16.OVA tratados com Ad5-CMV-mIL2 e OT-I mostraram um aumento em culas dendricas maduras (culas CD86 + CD11c +) no tumor, indicativo de apresentao de antigio aumentada . Por outro lado, maiores porcentagens de Tregs (células Foxp3 + CD25 + CD4 +) foram observadas nos grupos de combinação mIL2 / mTNFα quando comparados com as citocinas únicas. Esse fenômeno pode refletir um princípio básico em imunologia: sempre que há uma resposta imune, há uma resposta imunossupressora reacionária. Quanto mais forte a resposta imunológica, mais forte é a contra-resposta. Importante, e de acordo com o princípio acima mencionado, aumentos em Tregs não se correlacionaram com a resposta antitumoral, como a combinação dupla de citocinas resultou em eficácia superior.

O número ou proporção de subgrupos de linfócitos pode não contar a história completa da atividade imunológica, já que um número menor de células poderia resultar em mais resposta antitumoral se as células forem altamente ativas. ¹⁶Portanto, era promissor que não apenas os principais subtipos de linfócitos fossem mais frequentes em tumores tratados com IL-2, TNFα e OT-I, mas as células T também eram mais ativas nos tumores tratados triplamente. Além da infiltração de células T, observamos mais células B CD19 + em tumores B16.OVA tratados com vírus codificadores de IL-2. Curiosamente, a depleção de células B no modelo de melanoma B16 tem mostrado dificultar as respostas imunes antitumorais mediadas por CD4 / CD8 e resultar em aumento do crescimento do tumor . ⁴⁵Assim, a IL-2 poderia ter um importante papel indireto no aumento da imunidade antitumoral no modelo descrito aqui.

A expressão de PD-L1 em tumores foi regulada positivamente após tratamento de combinação. Este fenómeno pode ser explicado pelo aumento da infiltração de células T (como mostrado na imagem SPECT / CT) que segrega IFNg, um indutor conhecido de PD-L1 (ref. ⁴⁶ ). Em contraste , CD8 + TIL expressando o marcador de anergia PD1 foram negativamente regulados em tumores tratados com IL-2, sugerindo que a imunossupressão induzida por tumor poderia ser combatida com esta abordagem. É de notar que a regulação negativa de PD1 em T8 CD8 + foi observada no mesmo modelo de ratinho com IL-2 recombinante combinada com transferência de OT-I. ³⁶Além disso, um recente estudo de fase 1 com injeções intratumorais repetidas com o adenovírus oncolítico ONCOS-102 resultou em infiltração de células T CD8 + e aumento da PD-L1 em tumores sólidos. ⁴⁷

Estudos futuros poderiam se concentrar em adenovírus competentes para replicação codificando citocinas humanas, usadas em conjunto com transferência celular adotiva . Com relação aos testes in vivo , nós e outros utilizamos o hamstersírio como uma plataforma útil para estudar vetores de adenovírus humanos. ⁴⁸ , ⁴⁹ , ⁵⁰ , ⁵¹ Os linfócitos infiltrantes de tumor de tumores de hamster singeneicos foram recentemente caracterizados e cultivados ex vivo em nosso grupo ⁵² permitindo o estudo de adenovírus oncolíticos codificadores de citocinas humanas no contexto da transferência celular adotiva e em um modelo totalmente imunocompetente. Em conclusão, os dados aqui apresentados suportam a tradução clínica de adenovírus armados com citocinas combinados com a transferência adotiva de células T para o tratamento de tumores sólidos.

Materiais e métodos

Linhas celulares e vírus . A linha celular de melanoma B16.OVA do rato foi gentilmente cedida pelo professor Richard Vile (Mayo Clinic, Rochester, MN). L-929, CTLL-2 e 293 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Células B16-Blue IFN-α / β foram adquiridas da InvivoGen (San Diego, CA). Todas as linhas celulares foram cultivadas em condies recomendadas. Os adenovírus não replicantes Ad5-CMV-mifNg, Ad5-CMV-mIL2, Ad5-CMV-mIFNb e Ad5-CMV-mTNFα foram construídos inserindo cassetes de expressão comcitocinas murinas interferon gama (mIFNg), interleucina-2 (mIL2), interferão beta 1b (mIFNb) e factor de necrose tumoral-a (mTNFa) nolocal de clonagem múltipla do plasmídeo transportador pDC315 (AdMax, Microbix Biosystems, Mississauga, Canadá). Os plasmídeos de vaivém foram recombinados com pBHGloxdelE13cre (AdMax), que contém o genoma completo do adenovírus , e os plasmídeos de resgate resultantes foram transfectados para células 293 para gerar as construções finais do vírus. Ad5Luc1 foi descrito anteriormente. ⁵³

Funcionalidade de citocina . As culas 293 foram infectadas com 100 partulas virais / cula (VP / cula) com vus codificadores de citocina e Ad5luc1 (controlo negativo) (8 pos repetidos por vus). Os sobrenadantes foram recolhidos 48 horas mais tarde e filtrados através de filtros de membrana inorgânica de 0,02 µm (Whatman, Maidstone, UK). A bioactividade do mIFNb presente no sobrenadante foi confirmada com células sensor IFN B16-Blue IFN-α / β murino tipo I seguindo as instruções do fabricante. TNF-sensível rato L-929 de células foram usadas para confirmar a funcionalidade de mTNFα por co-cultura do sobrenadante com L-929 células semeadas numa placa de 96 poços (1 x 10⁴culas / po) durante 24 horas antes de determinarviabilidade celular utilizando o ensaio MTS (Promega, Madison, WI). A linha celular de IL-2-dependente, CTLL-2 foi utilizado para examinar a bioactividade de mIL-2 atrav da cultura das culas com o sobrenadante filtrou-se em uma placa de 96 poços (2,5 x 10⁴culas / po) durante 48 horas e determinação de células viabilidade . A funcionalidade do mIFNg foi confirmada estudando a capacidade do mIFNg para proteger as células L-929 da infecção pelo vírus da estomatite vesicular (VSV). L-929 de células foram semeadas numa placa de 96 poços (3,5 x 10 ⁴ culas / po) e os sobrenadantes foram incubados com as células durante 6 horas. Após a incubação, os sobrenadantes foram removidos e as células foram infectadas com 1 × 10⁴VP / poço de VSVestirpe M51 (gentilmente cedida pelo Dr. Markus Vähä-Koskela, Universidade de Helsinque). A viabilidade celular foi determinada 96 horas depois. Os produtos comerciais de citocina foram utilizados como controles positivos em todos os ensaios de funcionalidade (R & D Systems, Minneapolis, MN). Todos os ensaios de funcionalidade foram realizados em oito repetições.

Expressão do transgene . A produção de citocinasin vitrofoi medida a partirde cultura de célulassobrenadantes de células 293 infectadas com vírus (três poços em replicado por vírus) com ELISA kits: mIFNg (Abcam, Cambridge, Reino Unido), mIFNb (PBL InterferonSource, Piscataway, NJ), mIL-2 e mTNFa (IBL International, Hamburgo, Alemanha). Aexpressãoin vivode citocinas foi estudada emcamundongos C57BL / 6(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) implantados subcutaneamente com tumores B16.OVA e injetados uma vez com 1 × 10⁹VP intratumoralmente (n = 2–4). 72 horas depois, os tumores foram congelados em gelo seco e armazenados a −80 ° C. As medições de citocinas foram realizadas com conjuntos de CBA Flex (BD, Franklin Lakes, NJ) como descrito anteriormente ³⁶ e normalizadas para o conteúdototal de proteína .

Tratamentos de vírus. 0,25 x 10⁶culas B16.OVA foram injectados subcutaneamente em ratinhos C57BL / 6 (Harlan Laboratories) e tumores foram deixados a desenvolver-se até atingir um tamanho viável para injecção. Os ratinhos foram injectados intratumoralmente com 1 x 10 ⁹ VP / tumor (ou 0,5 x 10⁹VP de cada vírus em tratamentos de combinação TNFa / IL2) em 50 µL de PBS no mesmo dia em que as células T OT-I enriquecidas com CD8 + foram administradas. (Descrito abaixo). Os tratamentos de vírus continuaram a cada 7 dias e os tumores foram medidos com pinças digitais a cada 2-3 dias. n = 5 a 6 animais por grupo.

Transferência Adoptiva de células T Os esplenócitos de ratinhos transgénicos OT-I TCR (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram cultivados na presença de 160 ng / ml de mIL-2 (R & D Systems) e 300 ng / ml de CD3e anti-ratinho (clone 145-2C11, eBioscience, San Diego, CA) durante 3 dias antes do enriquecimento das células CD8a + foi realizado com o Kit de Isolamento de Células T CD8a + II (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células T enriquecidas foram cultivadas adicionalmente na presença de mIL-2 e anti-CD3e por 7 dias antes da transferência adotiva para camundongos portadores de tumor B16.OVA. Os ratos receberam 1,5 × 10⁶ Células T OT-I enriquecidas com CD8 + por via intraperitoneal em 100 µl de RPMI simples. Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Animais Experimentais da Universidade de Helsinque e pelo Governo Provincial do Sul da Finlândia.

Citometria de fluxo. Análises de citometria de fluxo foram realizadas de acordo com procedimentos estabelecidos anteriormente em nosso grupo. ³⁶Resumidamente, tumores extirpados foram empurrados através de filtros celulares de 70 µm e cultivados durante a noite em meio RPMI 1640 completo antes de armazenar asuspensão decélula únicaa -80 ° C para posterior análise.

Expressão de quimiocinas . Os tumores B16.OVA estabelecidos foram tratados uma vez comadenovíruse células OT-I. 7 dias depois os tumores foram recolhidos, congelados e armazenados a -80 ° C. A homogeneização do tumor e a análise de quimiocinas foram realizadas com o BD CBA Flex Sets, como descrito anteriormente. ³⁶

OT-I radiomarcação e SPECT / CT. ¹¹¹ A radio-marcação com oxidoona e a SPECT / CT foram realizadas conforme descrito anteriormente. ¹⁶ Resumidamente, 6 x 10⁶células T OT-I enriquecidas com CD8 + foram marcadas com¹¹¹ In-oxine durante 15 minutos e injectadas intraperitonealmente em ratinhos receptores (5,98 ± 0,53 MBq por animal). Nos dias 1, 2 e 4 ap a administrao de culas marcadas radioactivamente, os murganhos tratados com vus ( n = 3 por grupo de vus) e tratados de forma simulada ( n = 3) com uma cara gama de culas de quatro culasprclicas com sistema de CT integrado ( nanoSPECT / CT, Bioscan). Os resultados foram calculados como porcentagem da atividade no tumor da dose injetada dividida pelovolume do tumor (mm ³ ).

Análise estatística. As estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism 6 (GraphPad Software , San Diego, CA) e o SPSS versão 21 (SPSS IBM, Nova York, NY). Teste t de Student , análise de variância de medidas repetidas e modelo de efeitos mistos lineares em dados de volume relativo de tumor transformados por logaritmo ; P foram considerados significativos os valores de <0,05.

ACT

Parto Adenoviral do Fator de Necrose Tumoral α e Interleucina-2 Possibilita Terapêutica Celular Adotiva de Sucesso do Melanoma Imunossupressor